Survivin異常表達對前列腺癌轉移及TGF?β/Smad通路的調節作用

徐子寒，彭云，董世強，侯定坤，王海濤△

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性第2大常見惡性腫瘤，2018 年全球新確診PCa 患者127.6 萬例，死亡 35.9 萬例［1］。中國男性的 PCa 發病率也在快速上升［2］。大多數PCa 患者在確診時已經出現遠處轉移，治療手段局限于內分泌治療和放療。凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）在調控細胞周期和腫瘤免疫逃逸中發揮重要作用［3］。生存素（Survivin）是IAPs 家族中分子質量最小的成員，在結直腸癌［4］、胰腺癌［5］、肝癌［6］等多種腫瘤組織中廣泛表達。早期研究發現Survivin 在PCa 中參與去勢抵抗［7?8］，抑制細胞凋亡［9?11］。目前已發現在卵巢癌［12］和腎癌［13］中，Survivin 通過促進腫瘤細胞上皮?間質轉化（EMT）進程來增加腫瘤的侵襲性。轉化生長因子（TGF）?β/Smad 作為參與腫瘤細胞EMT進程的經典通路［14?15］，在乳腺癌［16］、肺癌［17］中發揮促進轉移的作用。因此，筆者推測Survivin可通過調節TGF?β/Smad通路促進腫瘤細胞發生EMT，進而促進PCa 的轉移。本文旨在闡明Survivin 在PCa 轉移中所發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 （1）組織標本。選取2018年1月—2019年1月天津醫科大學第二醫院和天津市泌尿外科研究所收集的15例良性前列腺增生（BPH）活檢標本和60例PCa活檢標本，60 例 PCa 中 Gleason 分級為 6、7、8、9+10 者各 15 例。（2）細胞及主要試劑。人前列腺增生上皮細胞株BPH 購自天津市泌尿外科研究所，人PCa 細胞株LNCaP、Du?145、PC?3 均購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。RMPI?1640 培養基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司。青/鏈霉素（100×）、總蛋白提取試劑、PMSF 溶液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Western blot 相關試劑購自北京索萊寶生物技術公司。兔抗人TGF?β1、Smad2/3、磷酸化Smad2/3（pSmad2/3）、Smad4、GAPDH 一抗購自英國Abcam 公司。Survivin、上皮細胞鈣黏素（E?cadherin）、神經鈣黏素（N?cadherin）、羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司。HiFi?Script cDNA第一鏈合成試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）試劑盒購自美國羅氏生物科技公司。CCK?8 試劑盒購自 MCE 公司。Transwell 小室與基質膠（Matrigel）購自美國 Corning 公司，SP?9001 免疫組化通用試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析TCGA 數據庫中Survivin 表達 登錄TCGA 數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/），進入Repository界面，選擇文檔類型為RNA?seq，選擇病例類型Prostate Gland，共有496 例PCa 數據。排除數據庫中腫瘤純度低于0.7 的標本、福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）和重復標本后，共收集PCa 標本467 例，癌旁組織標本52 例。利用R 程序（https://www.r?project.org/）對Survivin在PCa組織與癌旁組織、有無淋巴結轉移、不同Gleason分級中的表達情況和預后進行分析。

1.2.2 免疫組化染色 將石蠟包埋的組織標本切片于65 ℃孵育2 h，二甲苯中脫蠟復水后枸櫞酸鹽進行抗原修復，3%H2O2溶液孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。進一步用Survivin 單克隆抗體（1∶2 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000 稀釋），室溫放置15 min，最后用蘇木素與二氨基聯苯胺作顯色劑進行復染。由3 位病理科醫生獨立對BPH、PCa 標本的免疫組化結果進行評分。綜合組織染色強度和染色比例進行半定量分析，染色強度評分：0分（無色，無表達）、1分（淺黃色，弱表達）、2分（深黃色，中度表達）、3分（棕褐色，高表達）。陽性腫瘤細胞百分率評分：1 分（0～25%）、2 分（26%～50%）、3 分（51%～75%）、4 分（76%～100%）。最后用染色強度積分與陽性細胞比例評分的乘積評價陽性程度，根據總得分將組織免疫組化評分，分為低表達（1～4分）和高表達（5～12分）。

1.2.3 細胞培養、轉染及分組 BPH 細胞與PCa 細胞用含10%胎牛血清的RPMI?1640 培養基在37 ℃、5%CO2的培養箱中常規培養，每1～2 d 更換培養液，待細胞生長至80%～90% 時用胰蛋白酶消化傳代。Survivin 過表達（NM_001168.3）、敲低慢病毒質粒載體購自北京合生基因公司。取對數生長期的LNCaP 細胞和PC?3 細胞，以1×106個/孔接種于6 孔板中，待細胞密度為30%～50%時，LNCaP 細胞分別轉染Survivin 過表達慢病毒（Survivin?OE）組和對照慢病毒（Vector）組 ；PC?3 細 胞 分 別 轉 染 Survivin 敲 低 慢 病 毒（Survivin?KD）組和對照慢病毒（NC）組。Survivin shRNA 序列 ：5'?CACCGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGACGAATCTTGA?CAGAAAGGAAAGCGC?3'。NC 序列：5'?CACCGGTTCTCC?GAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA?3'。

1.2.4 Western blot 檢測 TGF?β/Smad 通路相關蛋白表達水平 用細胞總蛋白試劑提取4組細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度后取20 μg上樣，進行12%SDS?PAGE電泳，分離后電轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉，洗膜，加入兔抗人一抗（1∶2 000 稀釋）及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶5 000 稀釋），ECL 發光顯色，以GAPDH 蛋白作為內參照，用Image J 軟件對 Survivin、TGF?β/Smad 信號通路相關蛋白TGF?β1、pSmad2/3、Smad2/3、Smad4 和 EMT 相關蛋白 E?cadherin、N?cadherin條帶的光密度（OD）值進行分析，相對表達量=目標灰度值/內參灰度值。通過Western blot 檢測PCa細胞PC?3轉染Survivin敲低慢病毒與LNCaP轉染Survivin過表達慢病毒的效率。

1.2.5 細胞增殖能力檢測 采用CCK?8 法檢測細胞增殖能力。慢病毒轉染實驗分組同1.2.3，將細胞按照2 000個/孔接種至96孔板上，每組設3個復孔；于轉染后24、48、72、96 h向每孔加入CCK?8 試劑各10 μL，繼續培養2 h 后在酶標儀上檢測450 nm處的OD值，并繪制增殖曲線。

1.2.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力。在小室中鋪基質膠，用不含血清的RMPI?1640培養基懸浮細胞，按照PC?3 細胞2×104個/mL，LNCaP 細胞5×104個/mL 接種于上室中，下室中加入500 μL 完全培養基，繼續培養36 h 后取出。用4%多聚甲醛固定位于下室中的細胞，用蘇木素染色后在顯微鏡下拍照并計數穿膜細胞數。

1.3 統計學方法 利用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析并繪圖。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，2樣本均數比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和重復測量方差分析，兩個分類變量的關聯性用χ2檢驗進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA 數據庫中Survivin 表達與PCa 臨床特征及轉移的關系 TCGA 數據庫分析結果顯示，相較于癌旁組織，PCa組織中Survivin 的mRNA 水平升高（t=8.840，P＜0.01）。在PCa 患者中，出現淋巴結轉移的患者Survivin 表達水平高于無淋巴結轉者（t=4.725，P＜0.01）；且隨著 Gleason 分級 的 升高，Survivin 表達水平越高（F=4.780，P＜0.01）；Survivin高表達的PCa 患者的無進展生存時間明顯短于Survivin 低表達的患者（Log?rankχ2=17.814，P＜0.01）。見圖1。

2.2 PCa 組織標本中Survivin 蛋白表達與患者臨床特征的關系 免疫組化染色顯示，PCa 標本中Survivin 蛋白高表達比例（60.0%，36/60）明顯高于BPH 組織（26.7%，4/15），差異有統計學意義（χ2=5.357，P＜0.05）。Survivin在BPH和PCa中的表達情況見圖2。不同臨床特征患者Survivin 表達水平比較發現，Survivin 高表達比例T3+T4 期患者高于T1+T2 期，局部淋巴結轉移患者高于無淋巴結轉移者，有遠處轉移者高于無遠處轉移者，見表1。

2.3 PCa 和BPH 細胞系中Survivin 蛋白表達水平比較 BPH 細胞中 Survivin 蛋白表達水平（0.323±0.053）低于 PCa 細胞系 LNCaP（0.445±0.053）、Du?145（0.568±0.045）和 PC?3（0.792±0.044），差異有統計學意義（n=3，F=49.850，P＜0.01），見圖3。

2.4 敲低和過表達Survivin后PC?3和LNCaP細胞中Survivin 蛋白表達變化 在PC?3細胞中，Survivin 在Survivin?KD組（0.599±0.029）表達低于NC組（0.923±0.025），差異有統計學意義（n=3，t=14.770，P＜0.01）；在 LNCaP 細 胞 中 ，Survivin?OE 組（0.989±0.015）Survivin 表達水平高于Vector 組（0.633±0.020），差異有統計學意義（n=3，t=24.770，P＜0.01），見圖4。

Fig.1 Expression levels of Survivin mRNA in TCGA database of PCa patients圖1 TCGA數據庫中PCa患者Survivin mRNA表達水平

Fig.2 Expression levels of Survivin in BPH and PCa(Immunohistochemistry staining,×100)圖2 Survivin在BPH和PCa中的表達情況（免疫組化染色，×100）

Fig.3 Expression levels of Survivin in human benign prostatic hyperplasia and prostate cancer cell lines圖3 人前列腺增生細胞系和PCa細胞系中Survivin蛋白表達水平

Fig.4 Changes in Survivin expression after knocking?down and overexpressing Survivin圖4 敲低和過表達Survivin后其蛋白表達變化

2.5 敲低和過表達 Survivin 后 PC?3 和 LNCaP 細胞的增殖和侵襲能力變化 CCK?8 實驗結果顯示，在PC?3 細胞中，與 NC 組相比，Survivin?KD 組細胞增殖能力明 顯 下 降（n=3，F組間=2 033.000，F時間=577.900，F交互=125.700，P＜0.01）；在LNCaP 細胞中，Survivin?OE 組細胞增殖能力明顯高于Vector 組（n=3，F組間=1 794.000，F時間=396.500，F交互=82.130，P＜0.01），見圖5。Transwell實驗結果顯示，Survivin?KD組細胞侵襲數量明顯少于 NC 組［（43.67±4.73）個/視 野vs.（101.67±7.64）個/視 野 ，t=11.190，P＜0.01］；而 Survivin?OE 組細胞侵襲數量明顯多于Vector組［（63.67±5.03）個/視野vs.（33.33±3.51）個/視野，n=3，t=8.561，P＜0.01］，見圖6。

Fig.5 Thel proliferation curves of Survivin overexpression and knockdown in PCa cells圖5 敲低和過表達Survivin后PCa細胞增殖曲線

2.6 敲低和過表達 Survivin 后 PC?3 和 LNCaP 細胞EMT 相關蛋白表達變化 Western blot 檢測發現，在PC?3 細胞中，與 NC 組相比，Survivin?KD 組間質標志物N?cadherin 表達減少，上皮標志物E?cadherin表達增加。在LNCaP 細胞中，與Vector 組相比，Survivin?OE 組 E?cadherin 表達減少，N?cadherin 表達增加，見圖7、表2。

Fig.6 Transwell results in PCa cells after knocking?down and overexpressing Survivin圖6 敲低和過表達Survivin后PCa細胞Transwell實驗結果

Fig.7 Expression levels of EMT?associated proteins after knocking?down and overexpressing Survivin圖7 敲低和過表達Survivin后EMT相關蛋白表達

2.7 敲低和過表達 Survivin 后 PC?3 和 LNCaP 細胞TGF?β/Smad 通路相關蛋白表達變化 進一步探索Survivin調控腫瘤細胞EMT進程的機制發現，在PC?3 細胞中，與 NC 組相比，Survivin?KD 組 TGF?β1、pSmad2/3和Smad4表達減少（P＜0.01）；在LNCaP細胞中，與 Vector 組相比，Survivin?OE 組 TGF?β1、pSmad2/3、Smad4 均 表 達 增 加（P＜0.01），見 圖8、表3。

Tab.2 Comparison of the expression of EMT-associated proteins in PC-3 cells after knocking-down and overexpressing Survivin表2 敲低和過表達Survivin后EMT相關蛋白表達水平比較 （）

Tab.2 Comparison of the expression of EMT-associated proteins in PC-3 cells after knocking-down and overexpressing Survivin表2 敲低和過表達Survivin后EMT相關蛋白表達水平比較 （）

＊P＜0.01

組別NC組Survivin?KD組t Vector組Survivin?OE組t 3 3 3 3 1.009±0.025 0.724±0.034 11.780＊0.676±0.013 0.867±0.002 24.810＊0.242±0.006 0.995±0.029 44.530＊1.007±0.050 0.670±0.040 9.102＊n N?cadherin E?cadherin

Fig.8 Changes of TGF?β/Smad pathway?related proteins after knocking?down and overexpressing Survivin圖8 敲低和過表達Survivin后TGF?β/Smad通路相關蛋白表達變化

Tab.3 Comparison of TGF-β/Smad pathway-related protein levels in PC-3 cells after knocking-down and overexpressing Survivin表3 敲低和過表達Survivin后TGF-β/Smad通路相關蛋白表達水平比較 （）

Tab.3 Comparison of TGF-β/Smad pathway-related protein levels in PC-3 cells after knocking-down and overexpressing Survivin表3 敲低和過表達Survivin后TGF-β/Smad通路相關蛋白表達水平比較 （）

＊P＜0.01

組別NC組Survivin?KD組t Vector組Survivin?OE組t n3 3 3 3 TGF?β1 1.276±0.056 0.624±0.047 15.370＊0.719±0.006 1.033±0.002 79.110＊pSmad2/3 0.868±0.024 0.650±0.022 11.640＊0.854±0.030 1.174±0.032 12.590＊Smad4 0.813±0.040 0.582±0.063 5.353＊0.110±0.001 0.815±0.008 156.200＊

3 討論

雄激素剝奪是轉移性PCa（mPCa）的主要治療方案，但經過18～24個月的中位緩解期后，大多經過內分泌治療的患者最終會發展為趨勢抵抗性PCa（CRPC），導致腫瘤復發和疾病進展［18］。CRPC 預后極差，中位生存期僅為1 年［19］。隨著世界范圍內精準醫學的發展，腫瘤基因靶向治療在臨床治療策略中的重要性日益增加。利用生物信息學技術對臨床獲取的PCa 組織進行數據化分析，確定具有統計學意義的差異表達基因，并通過體外細胞學實驗和體內動物模型實驗進一步驗證差異基因的促癌機制，最終可以找出精準靶向癌基因的分子抑制劑，完成臨床轉化。

有研究發現Survivin 在多種腫瘤中表達明顯升高，并通過調節細胞周期［10］、抑制程序性凋亡［11］和促進EMT［12?13］發揮促癌功能，但對于Survivin是否促進PCa 轉移及EMT 具體機制的研究并未涉及。因此，本文將Survivin 確定為研究對象，探討其在PCa轉移中的作用。

在本研究中，首先利用生物信息學技術分析TCGA 數據庫 PCa 標本信息，發現 Survivin 在人 PCa中的mRNA 水平顯著增加，其過表達水平與出現淋巴結轉移有關。考慮TCGA數據庫主要收錄歐美人群PCa標本信息，因此筆者又收集了15例BPH標本和60 例PCa 臨床標本，利用免疫組化技術驗證Survivin 在中國PCa 患者中的表達水平，結果表明Survivin的蛋白質水平在PCa標本中明顯過表達，其高表達水平提示PCa 出現轉移、更差的臨床分期和不良預后。通過體外實驗發現，Survivin在人PCa細胞系中過表達，尤其是PC?3細胞系。細胞侵襲和增殖實驗結果表明，在前列腺細胞中Survivin過表達可以促進細胞增殖和侵襲；反之，敲低Survivin 明顯抑制細胞的增殖與侵襲，進一步證實了免疫組化結果。

TGF?β/Smad 通路通過磷酸化激活 Smad2 和Smad3 并與 Smad4 結合，三聚體磷酸化的 Smad 復合物轉移到細胞核內與轉錄因子共同介導EMT 靶基因的抑制或激活。同時，Smad復合物也可以在細胞核中誘導抑制上皮細胞的標志性蛋白miRNA 的表達，促進腫瘤的 EMT 進程［12，20］。在骨肉瘤［21］、結直腸癌［22］、非小細胞肺癌［23］中，Survivin 通過調節Smad2 磷酸化使腫瘤發生EMT。本研究發現，在PCa 細胞中敲低Survivin 可抑制TGF?β1、pSmad2/3、Smad4表達水平，抑制間質標志物N?cadherin 表達，促進上皮標志物E?cadherin表達；過表達Survivin可以促進Smad2/3發生磷酸化，增加TGF?β1、Smad4和間質標志物N?cadherin 表達，抑制上皮標志物E?cadherin 的表達，從而證實了Survivin 可以通過激活經典TGF?β/Smad通路來促進PCa細胞發生EMT。

綜上所述，Survivin 在前列腺腺癌中高表達，且與PCa的惡性程度及侵襲性有關，Survivin可以通過激活TGF?β/Smad 通路來促進腫瘤發生EMT，進而提高PCa 的轉移與侵襲能力。Survivin 是PCa 發生轉移的潛在生物標志物，靶向Survivin/TGF?β/Smad通路可能為轉移性PCa 患者提供新的臨床治療策略。