許雯，許永劼，劉歆蕾，沈婕，朱科靜，林海容，李興，潘衛，△

糖尿病腦病（diabetic encephalopathy，DE）是由糖尿病引起的神經退行性疾病，其發病機制復雜，可能涉及氧化應激、炎癥損傷、細胞凋亡等。研究發現糖尿病引起的學習和記憶缺陷可能由海馬神經細胞凋亡介導［1?3］。本課題組前期研究發現高糖能誘導小鼠海馬神經元HT?22 細胞凋亡，且隨著糖濃度的增加，細胞凋亡率顯著上升［4］。組蛋白乙酰化修飾在糖尿病及其并發癥的發生發展中起著重要作用［5］，其在組蛋白乙酰轉移酶（HATs）和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）的共同調控下能保持動態平衡，且對基因表達調控發揮重要的作用。組蛋白乙酰化與神經細胞凋亡相關［6］，HDACs SIRT6 能調控糖尿病視網膜病變的早期神經退行性病變［7］。但是，目前組蛋白乙酰化在DE 中的作用尚不清楚。曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）是一種廣譜組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi），它能通過增加細胞內組蛋白的乙酰化程度誘導細胞凋亡［8?9］。本研究利用TSA處理HT?22細胞，觀察HDACs對神經細胞凋亡的影響，為研究DE的發病機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 小鼠海馬神經元HT?22 細胞（中喬新舟公司）；0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、DMEM 培養基（美國Gibco 公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；TSA（美國CST公司）；兔源β?肌動蛋白（β?actin）多克隆抗體、兔源Bcl?2 相關X 蛋白（Bax）多克隆抗體、兔源B 淋巴細胞瘤?2（Bcl?2）多克隆抗體、兔源半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase?3）多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔抗體（武漢三鷹公司）；CCK8試劑盒（日本同仁公司）；酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；RIPA高效裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Annexin V?FITC/PI細胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。CO2培養箱（日本SANYO 公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon 公司）；Western blot 電泳儀、IMARK 型酶標儀（美國Bio?Rad公司）；流式細胞儀（美國Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取凍存的HT?22細胞于37 ℃水浴箱中復蘇，加入3 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養基，600 r/min，離心5 min，棄上清加入1 mL培養基重懸細胞，將細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃，5%CO2培養箱中進行培養、傳代，取對數生長期的HT?22 細胞進行后續實驗。

1.2.2 細胞分組 取對數生長期的HT?22 細胞分別用高糖培養基（葡萄糖濃度55 mmol/L）及普通培養基（葡萄糖濃度25 mmol/L）培養，高糖培養基及普通培養基各分為2組：對照組（NC組）、抑制劑組（TSA組，加入TSA干預細胞）。

1.2.3 TSA 母液制備 取 1 mg TSA 溶于 826 μL DMSO 溶劑中，得到濃度為4 mmol/L 的TSA 母液，使用時用培養基稀釋到相應濃度，剩余放置于?20 ℃儲存。

1.2.4 CCK8 法檢測細胞存活率 待細胞長到對數生長期，胰酶消化細胞，以1×105/mL密度均勻接種于96孔板，置于培養箱中培養24 h。實驗分組按照1.2.2，同時另設置空白組（不含細胞僅含有培養基）；分別用1 mmol/L 的TSA作用TSA組細胞1、4、8 h，以及之后用0.4 mmol/L的TSA作用TSA組細胞1、4、8、12、14、16、20、24 h，每組設置5個復孔，用高糖培養基及普通培養基分別將TSA 母液稀釋成相應濃度，以每孔100 μL 替換TSA 組原培養基；相應作用時間結束，棄去各組培養基，每孔加100 μL檢測液（90 μL培養基+10 μL CCK8試劑），避光放于37 ℃，5%的CO2培養箱中，反應2.5 h后，酶標儀檢測450 nm 處的光密度（OD）值。細胞存活率=（TSA 組OD 均值?空白組OD 均值）（/NC 組OD 均值?空白組OD 均值）×100%。選擇最適的作用時間和濃度為后續實驗的抑制劑作用條件。

1.2.5 ELISA 法檢測HADC 和HAT 活性 在酶標包被板上設標準品孔、空白孔、實驗孔，實驗孔分組按照1.2.2，用濃度為0.4 mmol/L的TSA作用TSA組20 h。標準品孔加不同濃度的標準品各50 μL，實驗孔加各組細胞裂解液各50 μL，空白孔不加；除空白孔外，其余孔各加HPR 標記的山羊抗兔抗體100 μL，經溫育、洗滌后，各孔加顯色劑 100 μL 避光反應15 min 后，各孔加終止液50 μL。用空白孔調零，酶標儀在450 nm 處檢測各孔OD 值，測定在加終止液后的15 min 內完成，計算出樣品的濃度。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 分組按照1.2.2，用濃度為0.4 mmol/L 的 TSA 作用 TSA 組 20 h 后收集細胞懸液，用 PBS洗 2 次，加入 500 μL Binding Buffer 重懸細胞，加入 5 μL Annexin V?FITC 混勻，再加入5 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光反應10 min，1 h以內上機檢測細胞凋亡率。

1.2.7 Western blot 檢測凋亡相關蛋白Bcl?2、Bax、Caspase?3表達情況 用濃度為0.4 mmol/L的TSA作用TSA組20 h后提取各組細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，用RIPA稀釋蛋白液，將各組蛋白濃度調至一致，按4∶1 體積加入5×loading buffer，混合液煮沸 10 min，使蛋白變性。以30 μg 為統一上樣量，濃度為12%的分離膠，通過SDS?PAGE 凝膠電泳分離目的蛋白，再將目的蛋白轉移到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，TBST 漂洗3 次，孵育一抗 β?actin（1∶5 000）、Bcl?2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caspase?3（1∶2 000）于4 ℃搖床過夜，TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，孵育二抗羊抗兔 IgG（1∶20 000）于室溫搖床1.5 h。ECL法顯影，收集圖像，Image J軟件進行分析，實驗獨立重復3次，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件分析處理數據，計量資料以均數±標準差（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSA 最適作用時間和濃度 CCK8 結果顯示，以1 mmol/L的TSA作用HT?22細胞1 h時，細胞存活率在80%左右；作用4 h 時，細胞存活率在60%左右；作用8 h時，細胞存活率＜50%。以0.4 mmol/L的TSA 作用 HT?22 細胞作用時間≤14 h 時，細胞存活率≥80%；作用16 h 時，普通培養基中細胞存活率為81%，高糖培養基中細胞存活率為73%；作用20 h時，高糖和普通培養基中的細胞存活率都在70%左右；作用24 h時，細胞存活率均＜50%。后續實驗以0.4 mmol/L、20 h為TSA最適作用條件，見圖1。

Fig.1 The effects of different action time on HT?22 cell activity圖1 TSA不同作用時間對HT?22細胞活性的影響

2.2 TSA 對不同糖濃度下HDAC 及HAT 活性的影響 在普通培養基和高糖培養基中，TSA 組HDAC濃度較NC組均減少，HAT增加（P＜0.05）。同時，高糖作用后 NC 組和TSA 組的HDAC 和 HAT 增加（P＜0.05），見表1。

2.3 TSA 對不同糖濃度下HT?22 細胞凋亡率的影響 在普通培養基和高糖培養基中，TSA組均較NC組細胞凋亡率增加（P＜0.05），且高糖培養基比普通培養基培養的細胞凋亡率更高（P＜0.05），見圖2、表2。

Tab.1 The effects of TSA on HDAC and HAT activities of HT-22 cells under different concentrations of glucose表1 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞HDAC和HAT活性的影響 （n=5，）

Tab.1 The effects of TSA on HDAC and HAT activities of HT-22 cells under different concentrations of glucose表1 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞HDAC和HAT活性的影響 （n=5，）

＊P＜0.05

組別NC組TSA組t HDAC（pmol/L）普通培養基28.19±0.64 17.62±0.58 27.320＊高糖培養基61.17±1.67 53.27±1.06 8.912＊t 41.089＊65.936＊組別NC組TSA組t HAT（μg/L）普通培養基29.48±0.71 42.41±0.87 25.766＊高糖培養基33.94±1.09 45.32±0.66 19.940＊t 7.649＊5.960＊

2.4 TSA 對不同糖濃度下凋亡相關蛋白表達的影響 Western blot 結果顯示，在普通培養基和高糖培養基中，NC 組與TSA 組Bax 表達均無顯著差異。TSA組均較NC組Bcl?2表達顯著下降，Caspase?3表達顯著增加（P＜0.05），見圖3、表3。

3 討論

DE是糖尿病最嚴重的并發癥之一，認知功能障礙是其重要的臨床特征。糖尿病會增加阿爾茨海默病和血管性癡呆發生的風險［10］。神經元凋亡和海馬神經受損是認知/記憶功能障礙（包括阿爾茨海默病）的主要因素［11］。研究發現，大腦的肥大細胞作為腦損傷的“第一反應者”在被激活后，會引起小膠質細胞激活和神經元凋亡，進而導致認知功能障礙［12］。另外，表觀遺傳機制已被證明對于調節神經元基因表達至關重要，從突觸可塑性到學習和記憶，其在許多神經元功能中扮演著重要的角色，特別是組蛋白乙酰化在這些過程中起重要作用［13］。HATs 和HDACs參與認知功能的調控，不同HAT或HDAC的突變或失調會導致神經功能障礙和神經變性。研究發現，HDAC2在賴氨酸乙酰化與突觸可塑性偶聯中起核心作用，并在認知障礙疾病中發揮重要作用［14］。同時，組蛋白乙酰化也影響神經細胞的凋亡。研究發現組蛋白乙酰化水平增加可通過減少大腦皮層細胞凋亡及促進神經元再生保護新生大鼠大腦皮層損傷，其機制可能與腦源性神經營養因子（BDNF）表達增加相關［15］。本研究以小鼠海馬神經元 HT?22 細胞為研究對象，發現在高糖作用后細胞凋亡增加，并且HAT及HDAC也顯著增加。

Fig.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT?22 cells under different concentrations of glucose圖2 TSA對不同糖濃度下HT?22細胞凋亡率的影響

Tab.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT-22 cells under different concentrations of glucose表2 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞凋亡率的影響（n=3，%，）

Tab.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT-22 cells under different concentrations of glucose表2 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞凋亡率的影響（n=3，%，）

＊P＜0.05

組別NC組TSA組t普通培養基6.00±0.20 27.43±0.55 63.357＊高糖培養基20.57±0.78 47.97±2.16 20.680＊t 31.456＊15.958＊

Fig.3 The effect of TSA on the expression of Bcl?2,Bax and Caspase?3 in HT?22 cells under different concentrations of glucose圖3 TSA對不同糖濃度下HT?22細胞Bcl?2、Bax和Caspase?3表達影響

Tab.3 Comparison of TSA on the expressions of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in HT-22 cells under different concentrations of glucose表3 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表達情況的比較 （n=3，）

Tab.3 Comparison of TSA on the expressions of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in HT-22 cells under different concentrations of glucose表3 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表達情況的比較 （n=3，）

＊P＜0.05

組別NC組TSA組t普通培養基Bcl?2 1.16±0.06 0.46±0.02 19.729＊Bax 1.00±0.06 1.08±0.04 1.925 Caspase?3 0.84±0.06 1.07±0.06 4.903＊組別NC組TSA組t高糖培養基Bcl?2 0.78±0.02 0.45±0.01 27.494＊Bax 1.06±0.04 1.09±0.04 1.030 Caspase?3 0.99±0.05 1.29±0.03 8.395＊

TSA 是一種廣譜的 HDACi，屬于 HDACi 氧肟酸鹽類，可作用于Ⅰ、Ⅱ類HDAC。TSA 可通過上調Caspase?8、Caspase?3 和 BH3 相互作用域死亡激動劑（Bid）等細胞中的促凋亡蛋白，下調Bcl?X1、髓樣細胞白血病蛋白?1（Mcl?1）和X 連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）等促進凋亡信號轉導，或通過線粒體介導的死亡途徑誘發細胞凋亡［16］。本實驗通過CCK8法檢測細胞活性，確定TSA 的最佳作用時間和濃度。TSA推薦的作用時間和濃度是12～18 h、0.4 mmol/L。但也有研究報道，通過CCK8 法確定TSA 處理肺腺癌A549細胞、肺鱗癌H520細胞的最適藥物濃度，即選取2.25～150 mmol/L間不同作用濃度，但是都是統一作用48 h，并沒有對時間進行確定［17］。筆者先以1 mmol/L 的TSA 作用細胞，發現對細胞活性的影響過大，不利于后續實驗；之后又用0.4 mmol/L分別作用各組細胞1、4、8、12、14、16、20、24 h，發現在20 h時抑制效果明顯，且不影響細胞的存活。因此，最終選擇0.4 mmol/L，20 h為最適作用條件。

Wei 等［18］發現 HDAC5 及其細胞內易位是調節神經元凋亡的多種途徑的關鍵效應因子。HDAC5均勻地分布于皮層神經元的細胞核和細胞質中，當N?甲基?D?天冬氨酸（NMDA）誘導的細胞發生凋亡時，核內的HDAC5 被快速磷酸化并轉移到細胞質，皮層神經元中核定位的HDAC5 的異位表達抑制了NMDA 誘導的細胞凋亡，在加入TSA 處理細胞后可抑制HDAC5對NMDA的作用，促進神經元凋亡。本研究通過抑制HDAC，觀察組蛋白乙酰化修飾是否影響小鼠海馬神經細胞HT?22 的凋亡，并利用TSA作用于正常及高糖條件下培養的HT?22 細胞，觀察其對細胞凋亡是否有影響。

組蛋白乙酰化和去乙酰化在神經元老化、萎縮和退行性疾病中起重要作用。Wang 等［19］發現TSA可能通過抑制多巴胺能神經元的存活率和增加其對神經毒素的易感性參與帕金森的發病過程。Salminen等［20］發現TSA能影響大鼠小腦顆粒神經元和小鼠神經母細胞瘤細胞的代謝，高水平的組蛋白乙酰化可誘導神經元應激反應和細胞凋亡發生。本研究中ELISA 結果顯示，TSA 作用后HDAC 活性降低，HAT活性增加；流式細胞術檢測發現細胞凋亡率顯著增加，且在高糖條件下，細胞凋亡更嚴重；在蛋白水平上，TSA 能顯著下調 Bcl?2 的表達，上調Caspase?3 的表達。這些結果表明TSA 可能通過抑制HDAC 增加組蛋白乙酰化水平，誘導小鼠神經元HT?22細胞的凋亡。

綜上所述，TSA能誘導HT?22細胞的凋亡，并且在高糖條件下，TSA對HT?22細胞凋亡的影響更大。TSA可能通過增加組蛋白乙酰化水平誘導神經細胞凋亡，從而參與DE認知功能障礙的機制。