lncRNA FOXCUT調控Notch通路抑制結腸癌細胞增殖、侵襲的實驗研究

佘明豪，劉寒松，楊文輝，余洋，張磊

結腸癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，其中約90%的早期患者可通過手術切除治愈，但由于其早期臨床癥狀不典型，多數患者確診時已進入中晚期，嚴重威脅人類健康［1］。研究結腸癌的發病機制，尋找新的有效治療靶點對于改善其預后、提高患者生存率和治愈率至關重要。長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，進化過程高度保守，可通過協同鄰近編碼基因表達發揮表觀遺傳、轉錄后調控功能，在結腸癌發生發展中起重要作用［2］。FOXC1 啟動子臨近轉錄體（FOXC1 promoter upstream transcript，FOXCUT）是一種位于促癌基因叉頭框基因FOXC1 啟動子上游的lncRNA。研究報道，FOXCUT在鼻咽癌［3］、結直腸癌［4］等多種癌癥中表達上調，但關于其對結腸癌細胞生物學行為的影響尚鮮有研究。Notch信號通路由受體、配體及細胞內效應器3部分組成。已有研究證實，Notch信號通路激活在結腸癌中發揮重要作用［5］。本研究擬探究FOXCUT 對結腸癌細胞增殖、侵襲的影響及是否亦通過調節Notch信號通路發揮作用，以期揭示其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Lipofectamine 2000 試劑盒（貨號L7800）、CCK?8 試劑盒（CA1210）購自北京索萊寶科技有限公司；FOXCUT siRNA及其陰性干擾序列由南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成；RNA提取試劑盒（貨號DP419）購自天根生化科技（北京）有限公司；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（貨號D7268S）購自上海碧云天生物技術有限公司；兔源一抗 anti?Notch1（貨號 ab52627）、anti?Hes1（貨號 ab108937）、anti?β?actin（貨號ab179467），二抗羊抗兔IgG（貨號ab6721）均購自英國 Abcam 公司。7500qPCR 儀、Evolution220 紫外分光光度計、Forma Steri?Cycle i160 5%CO2培養箱購自美國Thermo Fisher 公司；MODEL550 型酶標儀購自美國 Bio?Rad公司；ix73熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 組織來源 選取2018 年1 月—2019 年5 月期間于鄭州大學附屬鄭州中心醫院收治的30例患者的結腸癌及其癌旁組織標本，均經病理學確診。所有標本采集均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認，經本院倫理委員會批準通過。

1.2.2 細胞培養 人結腸癌細胞株SW480、SW620、HCT116、HT29及人正常結腸上皮細胞NCM460（均購自中國科學院上海細胞庫）采用含10%FBS、100 U/mL 青霉素和0.1 g/L鏈霉素的DMEM/F12培養基置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，取對數生長期細胞進行傳代培養，細胞傳代采用0.25%胰蛋白酶消化處理。

1.2.3 細胞轉染 取對數生長期HCT116細胞接種至6孔細胞板，待細胞匯合至80%時，采用Lipofectamine 2000試劑盒轉染FOXCUT siRNA（FOXCUT siRNA組）及轉染陰性siRNA為陰性對照組（FOXCUT siRNA?NC組），另設正常培養HCT116細胞為正常對照組（NC 組）。其中FOXCUT siRNA 序列：5'?AGAU?AAUUGUCUUAGUUCUCCAUCG?3'；陰性 siRNA 序列：5'?CGUAGUGCGUAGUGCUAGUGCGUAG?3'。具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，轉染后48 h收集各組細胞進行相關實驗檢測。

1.2.4 qPCR實驗檢測FOXCUTmRNA表達 提取結腸癌組織、癌旁組織、結腸癌細胞、正常結腸上皮細胞及轉染后各組細胞總RNA，反轉錄得到cDNA，置于?20 ℃保存備用。采用qPCR擴增FOXCUT及β-actin。其中FOXCUT引物：上游 5'?GTC?GCACCGATGACTAACG?3' ，下 游 5'?GCCCTCAAAGCC?GAACTG?3'；內參β-actin引物：上游 5'?GAGACCTTCAA?CACCCCAGCC?3'，下游5'?AATGTCACGCACGATTTCCC?3'。20 μL反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA（50 μg/L）2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，61 ℃ 31 s，40個循環。以β-actin為內參基因，FOXCUTmRNA相對表達水平采用2?ΔΔCt法進行定量分析。

1.2.5 CCK?8 實驗檢測轉染后各組細胞增殖情況 取對數生長期HCT116細胞接種至96孔細胞板，接種密度分別為0、625、1 250、2 500、5 000、10 000、20 000、30 000、40 000個/孔，各設置3個復孔，待細胞完全貼壁后，每孔加入20 μL CCK?8溶液，37 ℃孵育3 h，酶標儀下測定各孔450 nm波長處吸光度（A）值，求各接種密度下均值A，以接種密度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制CCK?8標準曲線。根據CCK?8標準曲線，取對數生長期HCT116 細胞接種至96 孔細胞板，接種密度1×104個/孔，細胞分組同1.2.3，分別于轉染48 h 后添加CCK?8 試劑，37 ℃孵育3 h 后，采用酶標儀檢測各組細胞于450 nm 波長處A值。

1.2.6 集落形成實驗檢測轉染后各組細胞克隆能力 各組HCT116 細胞培養14 d 后，采用純甲醇固定，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下計數細胞集落，以≥50 個細胞團塊計數為1 個集落。

1.2.7 Transwell 實驗檢測轉染后各組細胞侵襲能力 將轉染后各組HCT116 細胞用無血清培養基重懸，添加至包被Matrigel 的小室中，每個小室下室添加 500 μL 含 10%FBS 的DMEM/F12培養基，孵育48 h后棄去培養基，PBS洗滌后，4%甲醛固定，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下隨機讀取5 個視野計數侵襲細胞，取其平均值。

1.2.8 qPCR 檢測各組細胞Notch1、Hes1mRNA 表達 參照1.2.4方法檢測各組細胞Notch1、Hes1及β-actin。其中Notch1引物：上游 5'?GCTGACCTGCGCATGTCTGCCATG?3'，下游5'?CATGTTGTCCTGGATGTTGGCATCTG?3'；Hes1引物：上游5'?GCACAGAAAGTCATCAAAGCCTATT?3' ， 下 游 5'?GCTATCTTTCTTCAGAGCATCCAA?3'。以β-actin為內參基因，計算Notch1及Hes1mRNA相對表達水平。

1.2.9 采用蛋白免疫印跡（Western blot）實驗檢測轉染后各組細胞中Notch1、Hes1蛋白表達 蛋白提取試劑盒提取總蛋白，二喹啉甲酸法（BCA）法測定蛋白質濃度，依次進行SDS?PAGE、轉膜、封閉，添加一抗 anti?Notch1（1︰2 000）、anti?Hes1（1︰1 000）、anti?β?actin（1︰2 000），4 ℃孵育過夜，添加二抗IgG（1︰5 000）室溫避光孵育1 h，增強化學法顯影，蛋白條帶灰度值用Image J軟件分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，計量資料均采用均數±標準差（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），組間多重比較采用Bonferroni 校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXCUT 在結腸癌組織及結腸癌細胞中表達上調 與癌旁組織比較，結腸癌組織中FOXCUTmRNA 表達水平顯著增高（t=9.660，P＜0.01），見圖1A。與正常結腸上皮細胞NCM460 比較，結腸癌細胞株 SW480、SW620、HCT116、HT29 中FOXCUTmRNA 表達水平均顯著增高（P＜0.01），其中以HCT116 細胞中表達水平最高，因此選擇HCT116 細胞作為細胞載體進行下游試驗，見圖1B。NC 組與FOXCUT siRNA?NC 組 HCT116 細 胞 中FOXCUTmRNA 表達水平差異無統計學意義（t=0.540，P＞0.05）；與 FOXCUT siRNA?NC 組 比 較，FOXCUT siRNA 組 HCT116 細胞中FOXCUTmRNA 表達水平顯著降低（t=12.316，P＜0.01），見圖1C。

2.2 沉默FOXCUT 對HCT116 細胞增殖活力的影響 與 FOXCUT siRNA?NC 組（0.97±0.11）比較，FOXCUT siRNA 組 HCT116 細胞增殖活力（0.52±0.07）顯著降低（t=8.454，P＜0.01），見圖2。

2.3 沉默FOXCUT對HCT116細胞集落形成能力的影響 與FOXCUT siRNA?NC 組（127.49±16.35）比較，FOXCUT siRNA 組HCT116 細胞集落形成數量（38.17±10.81）顯 著 減 少（t=11.162，P＜0.01），見圖3。

Fig.1 Expression levels of FOXCUT in colon tissues and cells圖1 FOXCUT在結腸組織及細胞中的表達水平

Fig.2 CCK?8 standard curve圖2 CCK?8標準曲線

2.4 沉默FOXCUT對HCT116細胞侵襲的影響 與FOXCUT siRNA?NC 組（97.93±12.31）比較，FOXCUT siRNA 組HCT116 細胞侵襲數（38.83±10.97）顯著減少（t=8.780，P＜0.01），見圖4。

Fig.3 Effects of FOXCUT silencing on colony forming ability of HCT116 cells圖3 沉默FOXCUT對HCT116細胞集落形成能力的影響

Fig.4 Effects of FOXCUT silencing on invasion of HCT116 cells(×400)圖4 沉默FOXCUT對HCT116細胞侵襲的影響（×400）

2.5 沉 默 FOXCUT 對 HCT116 細 胞Notch1、Hes1mRNA表達的影響 與FOXCUT siRNA?NC組比較，FOXCUT siRNA 組 HCT116 細胞Notch1、Hes1mRNA表達水平顯著降低（n=6，t分別為11.658、8.445，均P＜0.01），見圖5。

Fig.5 Effects of FOXCUT silencing on Notch1 and Hes1 mRNA expression levels in HCT116 cells圖5 沉默FOXCUT對HCT116細胞Notch1、Hes1 mRNA表達的影響

2.6 沉默 FOXCUT 對 HCT116 細胞 Notch1、Hes1 蛋白表達的影響 與FOXCUT siRNA?NC 組比較，FOXCUT siRNA組HCT116細胞Notch1、Hes1蛋白表達水平顯著降低（t分別為 8.818、10.955，均P＜0.01），見圖6。

3 討論

Fig.6 Effects of FOXCUT silencing on Notch1 and Hes1 protein expressions in HCT116 cells圖6 沉默FOXCUT對HCT116細胞Notch1、Hes1蛋白表達的影響

3.1 FOXCUT 在結腸癌組織及細胞株中的表達情況 lncRNA在人類基因組中含量豐富，主要通過染色體重塑、基因印跡、降解和翻譯mRNA等形式發揮作用［6］。FOXCUT 是近年來新發現的一種 lncRNA，因位于FOXC1基因啟動子上游而得名，而FOX家族可通過多種機制促進腫瘤細胞轉移及侵襲，在結腸癌等惡性腫瘤進展中發揮重要作用［7］。孔祥盼等［8］研究報道，FOXCUT 在口腔鱗癌組織及細胞中高表達，抑制FOXCUT表達可體外抑制口腔鱗癌Tca8113細胞增殖和遷移。本研究發現，與癌旁組織及正常結腸上皮細胞相比，結腸癌組織及細胞株SW480、SW620、HCT116、HT29 中FOXCUTmRNA 表達水平均顯著增高，提示FOXCUT可能起促癌樣基因作用，其表達上調與結腸癌發生有關，但FOXCUT 與結腸癌細胞生物學行為的關系仍待進一步驗證。

3.2 FOXCUT 對HCT116 細胞增殖、侵襲能力的影響 TCGA數據庫顯示FOXC1和FOXCUT在胃癌組織中高表達，與腫瘤直徑、淋巴結轉移、TNM 分期、分化程度有關；體外實驗表明，抑制FOXCUT表達可抑制胃癌細胞增殖及侵襲，促進其凋亡［9］。本研究沉默 FOXCUT 后發現，與 FOXCUT siRNA?NC 組比較，FOXCUT siRNA 組 HCT116 細胞增殖活力、集落形成能力及侵襲能力均顯著降低，再次驗證了FOXCUT 在結腸癌細胞中的促癌樣作用，抑制其表達可抑制其惡性增殖及侵襲行為。此外，檢測FOXCUT表達有助于鼻咽癌［10］、頭頸部腫瘤［11］、三陰性乳腺癌［12］等多種腫瘤的早期診斷及預后評估，因此推測FOXCUT可能作為結腸癌診斷的潛在生物標志物。

3.3 FOXCUT 影響HCT116 細胞增殖、侵襲能力的機制 Notch信號通路幾乎涉及細胞所有的增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移及血管形成等活動，Notch 受體是細胞正常發育的決定性因素，目前已鑒定4 種Notch受體及5個相應配體，其異常表達與腫瘤細胞增殖密切相關［13］。Hes1 是 Notch 下游關鍵靶基因。研究證實，抑制Notch 通路可引起Notch1、Hes1等相關基因表達下調，PTEN 表達增加，進而負性調節PI3K/Akt 通路，參與調控食管癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移［14］。本研究發現，下調 FOXCUT 可降低Notch1、Hes1 mRNA 及蛋白表達水平，提示下調FOXCUT 抑制結腸癌HCT116 細胞增殖及侵襲能力可能與降低Notch1、Hes1表達、抑制Notch 通路激活有關。熊祎虹等［15］發現，激活Notch1可促進結腸癌細胞及其干細胞增殖，促進腫瘤發生，證實Notch 通路激活在結腸癌細胞增殖、侵襲等生物學行為中發揮重要作用，因此推測FOXCUT可能通過調控Notch信號通路影響結腸癌細胞的增殖和侵襲行為。

綜上所述，沉默FOXCUT可抑制結腸癌HCT116細胞增殖及侵襲，可能與抑制Notch 通路激活有關。本研究僅初步探究了FOXCUT 調控Notch 通路對結腸癌細胞生物學行為的影響，但關于FOXCUT 對Notch通路的調控作用是直接還是間接，是否還有其他信號通路參與，將是筆者下一步重點探究的內容。