楓香樹林揮發物和空氣負離子季節變化及對微生物數量的影響

馬玲，張靜，趙亞紅，王彬，韋賽君，呂嘉欣，高巖

（浙江農林大學，亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

植物揮發性有機物（Plant volatile organic compounds，PVOCs）是通過植物體內次生代謝途徑合成的低沸點、易揮發的小分子化合物，主要分為萜烯類、苯基/苯丙烷類和脂肪酸衍生物[1-2]，具有抑菌、殺菌、凈化空氣、消除疲勞等功效[3-4]。林富平等發現木犀Osmanthus fragra ns葉片釋放的VOCs（揮發性有機物）能降低空氣中微生物的數量[5]。Gomez-Rodriguez等發現萬壽菊Tagetes erect a釋放的揮發物可降低番茄枯萎病病菌Fusarium oxysporumsp.的孢子萌發率[6]。南美蟛蜞菊Wedelia trilobata釋放VOCs對水稻稻瘟病病菌Magnaporthe grisea、水稻紋枯病病菌Rhizoctonia solani和玉米紋枯病病菌的抑菌效果顯著[7]。Fadil等發現百里香Thymus mongolicus、迷迭香Rosmarinus officinalis和香桃木Myrtus communis精油對鼠傷寒沙門氏菌Salmnella typhimurium具有協同抑菌作用[8]。檸檬Citrus limon精油和歐洲銀冷杉Abies alba精油混合后能凈化室內空氣質量[9]。

空氣負離子是由植物的尖端放電和光電效應產生，具有殺菌、降塵、改善情緒的作用[10]。研究發現氣象因子、植被類型對空氣負離子濃度影響較大。潘輝等發現不同林分中空氣負、正離子濃度與空氣溫度、光照強度之間呈負相關，與空氣濕度呈正相關[11]。對四種植被類型的空氣負離子濃度調查發現自然林＞經濟林＞綠地＞農田[12]。空氣負離子濃度在生態環境和空氣質量評價體系中是不可或缺的重要指標之一。

楓香樹Liquidambar formosana屬金縷梅科Hamamelidaceae楓香樹屬Liquidambar落葉喬木。目前，對楓香樹的研究主要集中在繁育[13]、生理生化[14]、光合[15]等方面，但對楓香樹VOCs抑菌作用的研究較少。因此，本文以楓香樹為對象，研究了楓香樹單株釋放的VOCs和楓香樹林空氣VOCs成分，測定了林內空氣負離子濃度和微生物數量，分析了不同季節楓香樹林的抑菌特性和空氣負離子效應，以期為森林康養建設中的樹種選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣地

試驗樣地設在浙江省杭州市臨安區浙江農林大學東湖校區楓香樹林教學實習基地，地理坐標為119°43'39＂E，30°15'25"N，海拔約39 m，林下有人工栽植的菲白竹Pleioblastus fortunei和自然生長的馬蘭Aster indicus、爵床Justicia procumbens等草本植物，平均高度在30～50 cm，地被植物總蓋度約30%，周邊無其他樹木、機動車及其他污染源影響。屬中亞熱帶季風氣候區，溫暖濕潤，四季分明，雨熱同期，有梅雨季節，空氣濕潤。全年平均氣溫為16.4°C，年日照時數為1 939.0 h，1月溫度最低，日平均氣溫為5°C，極端最低溫度為－12°C；7月溫度最高，日平均氣溫為30°C，極端最高溫度為41°C，全年降水量為1 628.6 mm，年平均相對濕度在70%以上。

1.2 試驗材料和試驗林

楓香樹樹齡均在20 a左右，平均高約為15 m，平均胸徑約為25 cm，植株長勢良好，無病蟲害和機械損傷。楓香樹林為人工純林，土壤為紅壤，造林面積約900 m2，種植密度約為1 650株·hm-2，郁閉度0.8左右，平均枝下高約2 m，并以距林緣15 m處的無林地作對照。

1.3 VOCs采集與分析

楓香樹單株VOCs測定：于2019年5月多次選擇雨后晴朗無風天氣的9∶00－11∶00，采用QC-2型大氣采樣儀（北京市勞動保護科學研究所），采用動態頂空氣體循環采集法[16]采集活體楓香樹單株的VOCs，根據樹木平均高度采用五點采樣法選擇5株楓香樹單株，每株作為1個獨立實驗，共5次重復，采樣位置位于樹冠向陽背風中部健康無病蟲害枝葉，采集VOCs后采摘葉片稱量。氣體循環流量為100 mL·min-1，采氣時間為1 h。

楓香樹林分VOCs測定：于2019年春季（5月）、夏季（8月）和秋季（11月）多次選擇雨后晴朗無風天氣的9∶00－11∶00，采用開放式采樣法采集楓香樹林空氣VOCs。在距地面1.5 m處對楓香樹林空氣VOCs進行采集，均勻的選擇5個點，每個點作為1次獨立實驗，共5次重復。氣體循環流量為100 mL·min-1，采氣時間為1 h。

采用熱脫附-氣相色譜-質譜（TDS-GC-MS）聯用技術分析VOCs，儀器及參數設置條件參照高群英等的方法[16]。采用NIST2008譜庫檢索，并根據已報道的植物VOCs保留時間對VOCs各組分進行定性，然后選取特征離子進行進一步定量分析。楓香樹單株VOCs定量方法采用單位采樣時間內每克植物葉片釋放出的VOCs特征離子峰峰面積進行定量。

1.4 空氣負離子的測定

采用YZQ-308A森林康養檢測系統（翼鬃麒科技有限公司）于春季、夏季和秋季于楓香樹VOCs測定同時檢測楓香樹林和對照空氣負離子濃度，采樣高度為1.5 m，時間25 min，每5 min記錄一次數據，共5次重復（五點取樣法選5個點）。

1.5 培養基的配制

參照周德慶[17]的方法配置細菌培養基（牛肉蛋白胨培養基）、真菌培養基（馬丁氏培養基）、放線菌培養基（高氏1號培養基）。植物揮發性有機物單體培養基參照GAO Y等[18]的方法，無菌條件下，分別在檸檬烯、月桂烯、β-蒎烯、γ-萜品烯（Sigma公司生產）中加入兩滴吐溫，用無菌水將原液稀釋為100、200、1 000倍，分別取稀釋液1 mL加入培養皿中，再加入9 mL培養基，充分搖勻凝固后待用。

1.6 空氣微生物的采集

2019年春季（5月）、夏季（8月）和秋季（11月），多次選擇雨后晴朗無風天氣的10:00，采用自然沉降法采集空氣微生物（細菌、真菌和放線菌），分別在楓香樹林與對照地隨機各設5個采樣點，每次5個重復，將帶有不同培養基的培養皿分別放在距樹冠水平距離0.3 m左右，高約1.5 m的平板支架上，打開培養皿蓋，采集空氣中微生物，將培養基在空氣中暴露10 min后，蓋上培養皿蓋并用封口膜封好，置于30℃恒溫培養箱中培養48～96 h，細菌培養48 h，真菌培養72 h，放線菌培養96 h后，檢查菌落。

1.7 數據處理

按照1991年頒布的公共場所每立方米空氣微生物的計算公式，計算出各處理的微生物濃度[19]。

式中，N為培養皿中菌落的平均數（個）；A為培養皿的面積（cm2）；T為培養皿蓋打開的時間（min）。

式中，所有數據均為5次重復的平均值±標準誤差。

利用Origin 9.0軟件（OriginLab公司，美國）進行統計分析和作圖。采用One-Way ANOVA對楓香樹林和對照分別進行檢驗，并進行Tukey多重比較（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 楓香樹揮發物成分分析

楓香樹單株VOCs共鑒定出3類26種化合物（見圖1，表1）。由圖1和表1可知，VOCs以萜烯類物質為主要成分，共23種，主要有檸檬烯（22.4%）、月桂烯（12.3%）、β-蒎烯（13.7%）、γ-萜品烯（5.7%）、石竹烯（1.2%）、花柏烯（2.0%）等，占VOCs總量的96.6%；烴類物質僅1種為對傘花烴，占VOCs總量的1.4%；酯類物質有2種，分別為順-3-己烯乙酸酯（1.4%）和酞酸二乙酯（0.6%），占VOCs總量的2.0%。

圖1 單株楓香樹VOCs總離子流圖Figure 1 Total ion flow diagram of VOCs from single L.formosana

表1 楓香樹葉片釋放VOCs的主要成分Table1 Main component of VOCs from single L.formosana

2.2 不同季節楓香樹林空氣VOCs成分分析

由圖2和表2知，春、夏、秋季楓香樹林空氣VOCs共有7類28種化合物，主要以萜烯類、苯類物質為主，不同季節VOCs的種類與含量存在差異，夏季總釋放量分別是春、秋季的1.2倍、69.5倍。

圖2 不同季節楓香樹林空氣VOCs總離子流圖Figure 2 Total ion flow diagram of VOCs from L.formosana stand at different seasons

春季，共檢測出5類21種化合物，其中，萜烯類物質有5種，主要為檸檬烯（13.3%）、β-蒎烯（9.7%）等，占VOCs總量的28.4%；苯類物質有8種，主要為甲苯（16.5%）、乙苯（12.4%）等，占VOCs總量的44.1%；烴類物質有5種，主要為1,3,5-環庚三烯（10.1%）、庚烷（5.7%）、1,2-二氯乙烷（3.0%）等，占VOCs總量的20.1%；酯類物質有2種，分別為乙酸丁酯（1.0%）和鄰苯二甲酸二異丁酯（0.2%），占VOCs總量的1.2%；醇類物質有1種，為異植物醇，占VOCs總量的6.1%。

表2 不同季節楓香樹林空氣VOCs成分Table 2 Components of VOCs from L.formosana stand at different seasons

夏季，同樣檢測到5類21種化合物，其中，萜烯類物質有8種，主要成分為檸檬烯（16.6%）、β-蒎烯（10.6%）、月桂烯（4.6%）等，占總量的40.5%；苯類物質有7種，以甲苯（22.6%）、乙苯（4.6%）為主要成分，占VOCs總量的35.7%；酯類有2種，分別為乙酸丁酯（2.7%）和鄰苯二甲酸二異丁酯（9.1%），占VOCs總量的11.8%；烴類物質有3種，主要為庚烷（4.3%），占VOCs總量的6.8%；醇類物質僅1種，為異植物醇，占VOCs總量的5.1%。

秋季，共檢測到4類6種化合物，其中，苯類物質有3種，主要成分為甲苯（23.6%）、乙苯（6.3%）、鄰二甲苯（15.4%）等，占VOCs總量的45.2%；酸類物質有1種，為十六烷酸，占VOCs總量的35.4%；萜烯類物質有1種，為α-蒎烯，占VOCs總量的13.8%；酮類物質有1種，為2-十二烷酮，占VOCs總量的5.6%。

夏季，在對照空氣中共檢測到3類12種化合物，其中苯類物質有8種，占VOCs總量的87.4%；烴類物質有2種，占VOCs總量的4.6%；酯類物質有2種，占VOCs總量的8.0%。不同季節楓香樹林釋放的VOCs與對照對比，春、夏季楓香樹林內的VOCs總釋放量分別是對照的5.1和6.1倍，秋季楓香林內的VOCs總釋放量低于對照。

2.3 不同季節楓香樹林空氣負離子濃度變化

由圖3知，不同季節楓香樹林與對照空氣負離子濃度變化趨勢均為夏季最高，春季次之，秋季最低。夏季對照的空氣負離子濃度分別比春季和秋季增加了39.3%和55.6%，3個季節之間均差異顯著（P＜0.05）；夏季楓香樹林空氣負離子濃度分別比春季和秋季增加了41.9%和65.9%，與對照間均差異顯著（P＜0.05）；春、夏、秋季楓香樹林空氣負離子濃度分別比對照增加了61.8%、68.7%和29.5%，與對照間均差異顯著（P＜0.05）。

2.4 不同季節楓香樹林空氣微生物含量變化

由圖4知，楓香樹林內微生物數量在不同季節有一定的動態變化。夏季楓香樹林內的細菌含量比春季和秋季分別降低了112.0%和166.0%，與這二個季節之間均差異顯著（P＜0.05）；春、夏、秋季林內細菌含量與對照相比分別降低了27.9%、49.5%和18.9%，與對照之間均差異顯著（P＜0.05）。

圖3 不同季節楓香樹林空氣負離子濃度變化Figure 3 Variation of negative ion concentration in L.formo sana stand at different seasons.

圖4 不同季節楓香林空氣微生物含量Figure 4 Air microbe content in L.formosana stand at different seasons

夏季楓香樹林內的真菌含量比春季和秋季分別降低了48.6%和132.4%，與這二個季節之間均差異顯著（P＜0.05）；春、夏季與對照相比分別降低了21.4%和38.3%，與對照之間均差異顯著（P＜0.05）。放線菌數量變化趨勢與真菌一致，春、夏季與對照相比分別降低了12.6%和16.7%，與對照間均差異顯著（P＜0.05）。

2.5 VOCs單體對空氣微生物的抑制

由圖5知，隨著單體濃度的升高，β-蒎烯、檸檬烯、月桂烯和γ-萜品烯與對照相比對細菌的抑制作用增強，0.1%濃度β-蒎烯和檸檬烯處理與對照相比對細菌的抑制率分別為30.0%和34.6%（P＜0.05），1%濃度月桂烯和γ-萜品烯處理與對照相比對細菌的抑制率分別為31.4%和21.2%（P＜0.05）；1%濃度月桂烯、檸檬烯、γ-萜品烯處理與對照相比對真菌抑制率分別為28.7%、35.3%和32.1%（P＜0.05），隨著濃度的升高三種萜烯類處理與對照相比對真菌的抑制作用加強；0.1%濃度檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-萜品烯處理與對照相比對放線菌的生長影響不大，1%濃度時檸檬烯處理與對照相比對放線菌抑制率為27.8%（P＜0.05）。

圖5 單體對空氣微生物的抑制Figure 5 Inhibition of monomers on air microorganisms

3 討論

植物釋放VOCs的種類及含量與植物生長發育階段、體內合成相關酶的活性和環境因子密切相關。辣薄荷Mentha pi perita幼葉期釋放的VOCs以檸檬烯為主，隨著葉片的生長發育，釋放的VOCs以薄荷酮為主[20]。光照使黃花蒿Artemisia annuaβ-蒎烯合酶的表達水平增高[21]。木犀在盛花期釋放的萜烯類種類和含量高于衰敗期[22]。高溫能促進桉Eucalyptus camaldulensis和香蕉Musa nana葉片的單萜釋放[23-24]。迷迭香在干旱處理后其萜烯類的釋放量增加[25]。本研究中，楓香樹林空氣中的萜烯類含量主要由楓香樹的葉片釋放，春季、夏季和秋季隨著葉片生長發育階段的不同，萜烯類的種類和含量也不同，夏季成熟葉片釋放的萜烯類含量最高，秋季葉片衰老，VOCs大量減少。其原因一方面可能是受環境因素（光照、溫度、濕度）的影響，夏季光照時間變長，溫度逐漸升高，植物進入生長旺盛期，體內有機物合成、代謝加快，釋放VOCs的種類和含量增多[26-27]；同時，植物旺盛的光合作用為萜烯類合成提供充足的碳源和還原力，促進萜烯類合成[28]。秋季氣溫降低、葉片衰老，葉綠素降解，花青素含量增多，葉片變紅，花青素吸收的光不能用于光合作用，合成萜烯類的碳源和能量大量減少。另一方面可能是受相關生物合成酶的影響所致[29]，異戊烯二磷酸為底物，在萜類合酶的催化下合成單萜、倍半萜和二萜等，萜類合酶的活性和數量決定了萜類化合物種類和結構的多樣性[30]。這可能導致VOCs種類和釋放量多樣化。

空氣負離子濃度是衡量空氣清潔度與生態環境的重要指標之一，由植物尖端放電和光電效應產生，具有降塵、殺菌、凈化空氣的作用，其濃度受氣象因素、植被自身特性的影響[11-12]。馮燕珠等研究發現福州閩江公園空氣負離子濃度在秋季最高[31]。吳際友對空氣負離子濃度研究發現夏、秋季大于春、冬季[32]。這可能與環境因子、林分及觀測地區春、秋季的差異性有關。本研究中，春、夏、秋季楓香樹林內的空氣負離子濃度隨著VOCs的變化呈同步變化，以夏季林內空氣負離子濃度最高。這一方面可能是植物VOCs對空氣負離子的促進作用，植物VOCs中萜烯類是可以揮發的中性氣體分子，當受到碰撞（噴筒效應）、電場力（路德格效應）、輻射（光電效應）等外力作用影響時能產生較多的空氣負離子[33]；另一方面可能是夏季降水增多、植物生長旺盛、光合作用強，太陽紫外線強烈等因素產生了較多的空氣負離子，秋季溫度降低，葉片衰老，光合作用較弱，植物逐漸進入休眠狀態，林內的空氣負離子濃度減少。

植物釋放的VOCs具有抵抗病原微生物入侵、生長和繁衍，減少或殺死空氣微生物的作用[6,34]。Wang Y等研究發現肉桂醛可以顯著減少中華獼猴桃Actinidia Chinensis在貯藏期間微生物的數量[35]。本研究中，夏季楓香樹林釋放的VOCs以萜烯類為主，林內細菌、真菌、放線菌含量低于春季和秋季，不同季節楓香樹林內的細菌、真菌含量均顯著低于對照。魏琦等研究發現乙酸乙酯能抑制細菌生長[36]。高群英等研究發現壬醛、檸檬烯、β-蒎烯能抑制微生物生長[16]。植物釋放的VOCs對空氣中的微生物生長有抑制作用[6-7]。為了進一步探索楓香樹釋放的VOCs中具體抑菌物質，選擇萜烯類中含量較高的檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-萜品烯進行單體抑菌試驗，結果表明4種萜烯類均對細菌生長抑制作用顯著，檸檬烯、月桂烯、γ-萜品烯對真菌生長抑制作用顯著。檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-萜品烯可能是主要的微生物抑制劑。

4 結論

上述研究結果表明，單株楓香樹釋放的VOCs共鑒定出3類26種化合物，以萜烯類為主，春、夏、秋季楓香樹林中的空氣VOCs共有7類28種化合物，主要以萜烯類、苯類物質為主，其中，春季共有5類21種化合物，主要有檸檬烯、β-蒎烯、甲苯等；夏季共有5類21種化合物，主要有檸檬烯、β-蒎烯、甲苯等；秋季共有4類6種化合物，主要有甲苯、鄰二甲苯、十六烷酸等。不同季節VOCs的種類與含量存在差異，夏季總釋放量是春、秋季的1.2倍、69.5倍，夏季楓香樹林內萜烯類含量高于春季和秋季；不同季節楓香樹林中空氣負離子濃度變化趨勢為夏季最高，春季次之，秋季最低；楓香樹林內微生物數量在不同季節有一定的動態變化，夏季楓香樹林內萜烯類含量最高，細菌和真菌含量顯著降低，檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-萜品烯可能是微生物主要抑制物質。

基于目前植物VOCs排放的物種變化和不同植物VOCs對空氣負離子及微生物抑制作用的差異來看，建議在為城市環境選擇樹種時，除了考慮樹木的適應性、抗污染性和觀賞價值標準外，還應考慮植物的VOCs和空氣負離子濃度。