野生靈芝的分離鑒定及林下栽培技術研究

吳國華，付雅麗，葉茂平，童小青，饒雨欣，江宏，王勇軍,3

（1.浙江省龍泉市林業局，浙江 龍泉 323700；2.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300；3.浙江農林大學，省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

靈芝Ganoderma lucidum隸屬于擔子菌綱Basidiomycetes多孔菌目Polyporals多孔菌科Polyporaceae靈芝屬Ganoderma，被譽為百草之王，是中國名貴傳統中藥材，在我國已有2 000多年的藥用歷史，具有滋補強壯、扶正固本的功效[1]。靈芝及其孢子粉中含有多糖類、三萜類、蛋白質、甾醇類、核苷類、微量元素等生物活性成分[2]。現代臨床醫學研究證明，靈芝具有調節免疫、抗腫瘤、保肝解毒、抗衰老、抗神經衰弱、降血糖等功效[3-5]。我國在20世紀50年代首次成功栽培靈芝并逐漸實現了靈芝規模化生產，現已成為靈芝重要栽培和加工的國家[6]。據2015年數據統計，我國靈芝及孢子粉年產量約12萬t，產值達到16億美元[6]。浙江靈芝商品性生產始于20世紀70年代，已成為全國靈芝及孢子粉的主產區，主要集中在龍泉、慶元、蓮都、武義等生態環境優越的山區，其中龍泉靈芝孢子粉2011年被列為國家地理標志產品保護[7]。

目前，我國靈芝栽培主要以袋料栽培和段木基質栽培為主[6]。隨著靈芝需求量的提高，栽培場地的不斷擴大，新型栽培模式也在不斷探索。林下仿野生栽培，將菌絲袋料或段木覆土于遮陽較好的樹林下培育出芝，可有效克服栽培場地短缺、連作障礙等問題[8]，并具有產量高、生物轉化率高等優點，已在四川、福建等山區林地得到推廣和應用[9-10]。龍泉靈芝目前主要以大田栽培為主，主要栽培品種為‘滬農靈芝1號’，針對林下栽培尚無可大面積推廣的品種[11]。本研究從龍泉市森林中采集野生靈芝子實體并分離菌種，篩選生長性能優良的菌種并完成野生靈芝的鑒定，建立了野生菌株的林下栽培技術，旨在為龍泉靈芝提供新的菌種資源和林下栽培模式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種采集 2017年8月，在浙江省龍泉市蘭巨鄉梅地村天然林（地理坐標為119°7'41.22" E，27°56'56.43"N，海拔650～700 m）中進行野生靈芝采集，用小刀切取新鮮靈芝，連同菌柄和菌蓋，裝入取樣袋中，置于冰盒保存，記錄靈芝著生的宿主植物種類。從不同地點采集得到8個野生靈芝樣品，帶回實驗室進行分離及純化。龍泉市屬亞熱帶季風氣候區，年平均溫度為17.6℃，年平均降水量為1 664 mm，平均空氣相對濕度為79%，平均日照為1 823.8 h，無霜期為262 d。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0，121℃下高溫滅菌20 min。木屑麥麩培養基（原種培養基）：木屑750 g，麥麩240 g，石膏10 g，水1 200 mL，pH 6.5，采用100℃下常壓滅菌24 h。段木栽培基質：將供試的直徑為5～8 cm的板栗Castanea mollissima、楓香樹Liquidambar formosana、青岡Cyclobalanopsis glauca或麻櫟Quercus acutissima的多年生枝條鋸成30 cm長的段木，分別裝入高密度低壓聚乙烯筒袋內，每袋裝入7根相同段木，采用100℃下常壓滅菌24 h。

1.1.3 栽培場地 栽培場地設置在浙江省龍泉市蘭巨鄉梅地村附近的次生林中，地理坐標為119°7'41.20" E 27°56'56.43" N，海拔500～700 m，坡度在25°～30°，林地以闊葉樹種為主，主要包括楓香樹、青岡等，土質疏松，偏酸性沙質土，經間伐后林分郁閉度分別為0.4、0.6和0.8。

1.2 試驗方法

1.2.1 靈芝菌絲分離純化 將采集到的靈芝樣品用75%酒精表面消毒10 s后，用無菌水沖洗2遍，用無菌剪刀在靈芝菌蓋嫩邊圈剪取長、寬均為1 mm大小的邊緣菌塊，將菌塊接種于PDA培養皿中，避光條件下28℃培養。待長出菌絲，用挑針挑取少量菌絲置于新鮮PDA培養皿中，進行培養，觀察菌絲形態，獲得純培養物。按菌種生長速度，選出菌絲生長最快的靈芝菌種作為研究菌種。

1.2.2 掃描電鏡觀察 選出生長最快的菌種作為研究菌種，取該靈芝孢子粉用無菌水重懸后，加入2.5%戊二醛于4℃下浸泡過夜，加入磷酸緩沖液（pH 7.0）浸泡15 min，浸洗3次，再用1%鋨酸溶液固定樣品1～2 h，再用磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗15 min，隨后依次將樣品浸泡于30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液中，每次浸泡15 min。移除乙醇溶液，用100%乙醇洗脫20 min，洗脫2次，然后用乙醇與乙酸異戊酯溶液（1/1，V/V）浸沒30 min后，用100%乙酸異戊酯浸沒樣品2 h，晾干備用。將樣品在臨界點進行鍍金，放置于掃描電子顯微鏡（Phenom ProPW-100-011，荷蘭）下進行觀察。

1.2.3 ITS-PCR及測序 采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（生工?，上海）提取靈芝菌絲的總DNA，采用真菌核糖體基因間隔區（ITS）通用引物 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對基因組DNA進行PCR擴增[12]。擴增反應為：94℃/5 min；94℃/45 s，55℃/45 s，72℃/1 min，共30個循環；72℃/8 min。將擴增得到的PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測序，采用DNAMAN軟件進行拼接。序列采用MEGA 7.0軟件進行系統發育樹構建，采用Maximum likelihood analysis進行分析，自展數據（bootstrap）為1 000次[13]。

1.2.4 靈芝菌包的制備 將在PDA上生長的靈芝菌絲，接入原種培養基中，在黑暗條件下18～22℃進行發菌；待白色菌絲長滿原種培養基菌袋后，在無菌條件下用鑷子取含有菌絲的培養料，加入供試的4種段木栽培基質的兩端，扎口后，置于黑暗條件下22～24℃進行發菌；20～30 d后，待菌絲長滿段木表面1周后，取出移至林地進行栽培。

1.2.5 靈芝林下栽培管理及采收 根據林區山坡的特征，設計靈芝菌包的排放位置，并進行起壟，每排靈芝菌包間隔25 cm，每壟安排4排菌包。在2018年4－5月選擇晴天排放菌包，通風15～20 d后脫去菌袋，覆蓋厚度1～2 cm泥土，再在泥土上蓋一層樹葉；出芝后，保持濕潤通氣，當大部分靈芝菌蓋表面色澤一致，邊緣無嫩邊圈時，即行采收。采用套筒采集法進行孢子粉采收，將靈芝菌蓋和接粉薄膜上的孢子粉刷下，將收集到的孢子粉放置在干凈容器里。

1.2.6 不同段木對靈芝林下栽培影響的小區設計 將用板栗、楓香樹、青岡和麻櫟4種不同段木栽培基質制備的靈芝菌包進行標記，于2018年4月，隨機擺放在壟上，每壟擺放不同段木制備的靈芝菌包各20個，共3壟。約70天后，待靈芝孢子不再大量產生，進行孢子粉采收。取試驗區每個靈芝，進行菌柄長度、菌蓋直徑、生物轉化率、子實體干質量、孢子粉質量等指標進行測定。生物轉化率（%）為子實體干質量和孢子粉質量之和占接種前段木質量的百分比。粉芝比（%）為靈芝孢子粉質量與子實體干質量的比例。

1.2.7 林間不同郁閉度對靈芝林下栽培影響的小區設計 適當間伐，采用樹冠投影法確定林分郁閉度，得到郁閉度分別0.4、0.6和0.8的林下栽培區。栽培區樹種主要為青岡和楓香樹，樹齡約為20年，樹高6～8 m。于2018年4月，將菌包排放在不同郁閉度的林區，每個郁閉度的林區設置3壟，每壟放置20個菌包。待靈芝孢子不再大量產生，進行孢子粉采收。取試驗區每個靈芝，進行菌柄長度、菌蓋直徑、生物轉化率、子實體干質量、孢子粉質量等指標進行測定。

1.2.8 設置靈芝棚對靈芝林下栽培影響的小區設計 于2019年4月，根據上年段木篩選試驗結果和郁閉度試驗結果，在麻櫟段木栽培和林分郁閉度為0.8的栽培條件下，進行靈芝棚對靈芝生長及孢子產量的比較試驗。處理組采用在靈芝菌包林下擺放并覆土后，用塑料膜支起50 cm高的靈芝棚蓋住整壟，待到靈芝菌蓋嫩邊圈消失后，撤下靈芝棚，空白組不設置靈芝棚，每個處理設置3壟，每壟放置20個菌包。待靈芝孢子不再大量產生，進行孢子粉采收。取試驗區每個靈芝，進行菌柄長度、菌蓋直徑、生物轉化率、子實體干質量、孢子粉質量等指標測定。

1.2.9 統計分析 所有數據采用SPSS 19軟件進行統計分析，采用Duncan新復極差法進行多重比較，采用t檢驗對兩組數據進行比較。

2 結果與分析

2.1 不同靈芝菌種的生長速度測定

將采集到的8個野生靈芝樣品進行培養，得到純菌絲體，分別命名為LQ01、LQ02、LQ03、LQ04、LQ05、LQ06、LQ07、LQ08菌種。將這8個菌種分別在PDA和原種培養基上進行接種，測定菌絲的生長速度，結果如表1。由表1可知，從板栗上分離的菌種LQ06在PDA和原種培養基上的生長速度均顯著高于其他菌種（P＜0.05），在PDA上第5天就長滿整個培養皿，接種原種培養基后，第14天菌絲平均直徑達到16.12 cm，表現出優良的生長性狀。因此，本研究選擇菌種生長最快的LQ06作為其他試驗的菌種。

表1 不同菌種在PDA和原種培養基上的生長Table 1 Growth of isolated 8 strains on PDA and primary stock substrate

2.2 靈芝菌種LQ06的生長特性及ITS序列分析

LQ06菌絲體在PDA培養基上呈現濃密白色，較纖細，粗細均勻，菌絲透明（圖1A）。擔孢子呈橢圓形，表面有網紋孔格，大小為（5.3～6.4）μm×（2.7～3.8）μm（圖1B）。PCR擴增獲得菌株LQ06的ITS部分序列，NCBI登錄號為MT936513。利用MEGA 7.0軟件構建的系統發育樹分析結果顯示，LQ06與靈芝G.lucidumDai2272菌株和G1T099菌株親緣關系最近，與G.lucidumDai2272的相似度為97.09%，構成一個分支（圖2）。菌絲和擔孢子形態以及ITS序列比對結果進一步明確了菌株LQ06為靈芝屬靈芝種G.lucidum真菌。

圖1 靈芝LQ06菌絲（A）和擔孢子（B）形態Figure 1 The mycelium of G.lucidum LQ06 growing on PDA (A)and morphology of basidiospores

圖2 基于ITS序列構建的系統發育樹Figure 2 Phylogenetic tree inferred from the Maximum likelihood analysis based on the ITS dataset

2.3 林下栽培過程中靈芝LQ06的生長特征

將得到的靈芝菌種LQ06經試管母種生長和原種擴繁后，接種于消毒后的麻櫟段木栽培基質上，進行發菌處理，待到菌絲布滿菌棒后，于2020年5月移至林地（圖3A）。30 d后，進入出芝期（圖3B），隨后菌蓋不斷展開，菌柄伸長，約45 d后，菌蓋嫩邊圈開始消失，菌蓋顏色呈現赤色，50 d后，菌蓋嫩邊圈完全消失，擔孢子開始從菌蓋下表面的多孔中開始產生（圖3C）。

2.4 不同段木栽培基質對林下栽培靈芝LQ06的生長性狀及孢子產量的影響

選擇楓香樹、板栗、青岡、麻櫟4種段木栽培基質進行靈芝LQ06的栽培，結果如表2。

表2 不同段木栽培基質對林下栽培靈芝生長性狀和孢子產量的影響Table 2 Effect of different cut logs on growth traits and spores yield of G.lucidum LQ06 cultivation under forest

由表2可知，以麻櫟作為段木栽培基質的靈芝生長最快，在靈芝孢子粉不再大量產生時，菌柄平均長度達到9.57 cm，菌蓋平均直徑達到19.61 cm，生物轉化率為6.14%，每個成熟靈芝子實體平均干質量為112.56 g，孢子粉平均質量為108.54 g，粉芝產量比為96.43%。以青岡、板栗、楓香樹為段木栽培基質的靈芝生長和孢子粉質量均顯著低于麻櫟（P＜ 0.05）。

2.5 不同郁閉度對林下栽培靈芝LQ06的生長性狀及孢子產量的影響

以麻櫟段木為栽培基質，選擇不同郁閉度的林地進行靈芝菌種LQ06的栽培，結果如表3。由表3看出，在郁閉度為0.6和0.8的林地栽培的靈芝生長較好，其菌柄長度、菌蓋直徑、生物轉化率、單個子實體干質量以及孢子粉質量，均顯著高于郁閉度為0.4的林地（P＜ 0.05）。郁閉度為0.6和0.8的林區栽培的靈芝之間無明顯差異。

圖3 靈芝林下栽培現場（A）及子實體生長發育過程（B和C）Figure 3 The cultivation of G.lucidum LQ06 under forest (A)and development of fruiting body (B and C)

表3 不同郁閉度對林下栽培靈芝的生長性狀和孢子產量的影響Table 3 Effect of different crown density on growth traits and spores yield of G.lucidum LQ06 cultivation under forest

2.6 靈芝棚搭建對林下栽培靈芝LQ06的生長性狀及孢子產量的影響

在以麻櫟段木為栽培基質和郁閉度為0.8的栽培條件下，搭建靈芝棚，測定搭建靈芝棚對靈芝生長性狀和孢子產量的影響，結果表4。由表4可以看出，搭棚組靈芝的菌柄平均長度為12.04 cm，顯著高于無棚對照組（8.72 cm），兩處理的菌蓋直徑無顯著差異，有棚組的生物轉化率為5.63%，顯著高于對照組（P＜ 0.05）；有棚組的單個靈芝子實體干質量為163.43 g，孢子粉平均質量為152.37 g，均顯著高于對照組（P＜ 0.05）。

表4 靈芝棚搭建對林下栽培靈芝的生長性狀和孢子產量的影響Table 4 Effect of greenhouse on growth and spores yield of G.lucidum LQ06 cultivation under forest

3 結論與討論

3.1 討論

優良的菌種資源是靈芝育種和栽培的重要前提[14-15]。當前，靈芝菌種的鑒定主要以擔孢子形態、子實體形態以及真菌ITS序列為參考指標[16]。LQ06的擔孢子呈橢圓形，表面有網紋孔格，其形態特征及大小與G.lucidumDai2272相似[12]，子實體為典型赤色，ITS序列分析結果發現LQ06與來源于中國的G.lucidumDai2272[12]和意大利的G.lucidumG1T099[17]親緣關系最近，與G.lucidumDai2272[12]的相似度為97.09%，基于此確認其為G.lucidumDai2272，這為龍泉林下栽培提供了新的菌種資源。

靈芝林下栽培與其他栽培環境相比，存在著自然環境不可控制、生長速度較為緩慢等問題。靈芝在不同基質營養、光照、溫度等不同環境下，生長和發育均會表現出差異[10,18-19]。本研究針對靈芝LQ06菌種林下栽培中的段木基質、林區郁閉度以及搭建靈芝棚等因素對靈芝生長和孢子粉產量的影響進行了分析。初步明確了靈芝LQ06林下栽培過程中，以麻櫟作為段木基質、林間郁閉度在0.6～0.8為宜。同時，參照龍泉靈芝大田栽培技術[11]，覆土后搭建靈芝棚，可保證出芝期靈芝幼嫩組織能快速健康生長，有效促進靈芝的生長和提高孢子粉產量。

本研究中靈芝菌種LQ06在浙江龍泉的林下栽培得到的每顆靈芝孢子粉平均產量為152.37 g，雖不及‘滬農靈芝一號’在大田栽培的產量（每顆靈芝產孢子粉178.5 g）[20]，但在耕地少的山區開展林下栽培具有推廣意義。不同栽培條件下靈芝孢子粉中藥效成分可能存在差異，后續將進一步研究該菌種孢子粉破壁后有效成分含量及藥理。

3.2 結論

本研究從浙江龍泉森林中獲得了一個具有生長優勢的野生靈芝菌株，通過形態學和ITS序列分析，進一步明確了該菌株為靈芝屬靈芝種真菌G.lucidumDai2272，建立了該菌株麻櫟段木栽培、林分郁閉度0.6～0.8之間、早期搭建靈芝棚等林下栽培技術，達到了單顆靈芝產孢子粉質量超過150 g的栽培效果，為靈芝林下栽培及龍泉林下經濟發展提供了新的菌種資源和技術支持。