曲古霉素A 對人膀胱癌細胞EJ 增殖的影響及其作用機制△

冷俊，周曄，施利琴，張莉

上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院檢驗科，上海 202150

膀胱癌是常見的泌尿系統惡性腫瘤。2013 年，中國的膀胱癌新發病例數已達7.44萬，且其生物學行為呈多樣性。大部分膀胱癌患者于初診時處于淺表性膀胱癌階段，但術后容易復發、轉移，病死率較高。目前，以多柔比星、絲裂霉素等藥物為主的常用術后化療方案效果一直不甚滿意，因此，臨床需要尋找一種新型藥物治療途徑防止膀胱癌術后復發。近年來，組蛋白去乙酰化酶抑制劑為腫瘤治療提供了新的思路，而曲古霉素A（trichostatin A，TSA）作為其中的一種代表藥物，可抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移。WNT抑制因子 1（WNT inhibitory factor-1，WIF-1）作為 WNT信號通路的重要拮抗物，與腫瘤的發生、發展密切相關。本研究以體外培養的人膀胱癌細胞EJ為模型，觀察了不同濃度的TSA對膀胱癌細胞EJ增殖及WIF-1基因表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人膀胱癌細胞株EJ購于美國菌種保藏中心，TSA、碘化丙啶、胰蛋白酶均購于Sigma公司，RNA抽提試劑TRizol購于Invitrogen公司，EZ ChIPChromatin Immunoprecipitation Kit購于Upstate公司，Anti-acetyl-Histone H3（Lys9）購于Abcam公司，逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司，RPMI 1640培養液、胎牛血清均購于Gbico公司，Taq Plantinum PCR Master-Mix購于TIANGEN公司，青、鏈霉素均購于碧云天公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將膀胱癌細胞株EJ置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基中，在37 ℃、5% CO、100%飽和濕度的孵箱內進行培養。視細胞生長情況換液、傳代。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl terazolium，MTT）比色法 取對數生長期的人膀胱癌細胞EJ接種于96孔培養板中，每孔約含1×10個細胞，置入培養箱，待細胞貼壁后進行實驗：培養液中含終濃度為 0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.6 μmol/L TSA 和僅加RPMI 1640培養液的空白對照。每組設3個復孔。繼續培養，于24、48、72 h分別取生長良好的細胞測定細胞增殖抑制率，分析TSA對細胞增殖活性的影響。空白孔調零，采用酶標儀于490 nm波長處分別檢測24、48、72 h后細胞的吸光度（absorbance，A）值。細胞增殖抑制率=1-細胞存活率；細胞存活率=實驗細胞的平均OD值/空白對照細胞的平均OD值。實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期分布情況 以1×10/ml的密度將處于對數生長期的人膀胱癌細胞EJ接種于6孔培養板內，加藥處理，TSA的終濃度分別為0.2、0.4、0.8 μmol/L，空白組不加任何藥物；置入孵箱中繼續培養，72 h后胰蛋白酶消化回收細胞，在4℃下以1000 r/min的速度離心5 min，離心半徑10 cm。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，70%冰乙醇固定，加入RNaseA（終濃度為0.1 g/L）處理30 min，加入0.05 g/L碘化丙啶250 ml，室溫避光染色30 min后上機檢測。實驗重復3次。

1.2.4 實時熒光RT-PCR法檢測WIF-1mRNA相對表達量 實驗細胞分別加入終濃度為0.2、0.4、0.8 μmol/L的TSA混合培養液，空白對照細胞加入等量的RPMI 1640培養液，于72 h后收集細胞。用Trizol試劑抽提細胞總RNA，按照TaKaRa公司SYBR Prime ScriptRT-PCR Kit試劑盒操作說明書的步驟進行實時熒光RT-PCR檢測。采用20 ml反應體系，采用Roche公司生產Light Cycler熒光定量分析儀進行熒光定量分析。以β-actin為內參，上游引物為5'-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3'，下游引物為5'-AGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGA-3'，擴增長度為157 bp；WIF-1的上游引物為5'-TCTGTTCAAAGCCTGTCTGC-3'，下游引物為5'-CCTTTTATTGCAGTGTCTTCCA-3'，擴 增 長 度 為111 bp。采用 2法分析細胞中 WIF-1 mRNA 的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.5 染色質免疫沉淀實驗（Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP ） 將人膀胱癌細胞EJ以適宜的密度接種于15 cm的培養皿內，待細胞鋪滿至培養皿的70%后，分別加入終濃度為0.2、0.4和0.8 μmol/L的TSA進行干預，空白對照細胞不加藥，繼續培養72 h后收集細胞。按照EZ ChIPChromatin Immunoprecipitation Kit試劑盒說明書步驟進行DNA-蛋白質交聯、細胞裂解、超聲破碎DNA、免疫沉淀、逆轉蛋白質-DNA交聯、純化DNA及PCR，將免疫沉淀后的PCR擴增產物于2%的瓊脂糖凝膠電泳。試劑盒內含有陰性對照和陽性對照，以保證實驗的有效性。陽性對照抗體是RNA聚合酶Ⅱ的小鼠單克隆抗體，用于檢測人源的RNA聚合酶Ⅱ。陰性對照為正常小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG），用于控制染色質的非特異性免疫選擇。對照引物用于擴增人GAPDH啟動子區域，上游引物為5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'，下游引物為5'-GCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'，擴增長度為 167 bp；WIF-1 啟動子區上游引物為5'-CGCACCGCACTGTGAA-3'，下游引物為 5'-AACAGAAGAGCGGGAAGG-3'，擴增長度為154 bp。以抗乙酰化組蛋白H3中第9位賴氨酸（histone H3 lysine 9，H3-K9）抗體作為一抗，當特定基因啟動子區存在乙酰化組蛋白H3-K9時，則可將對應基因片段免疫沉淀，最終通過逆轉交聯、純化DNA及PCR擴增出目的產物，目的產物的多寡與基因啟動子區組蛋白H3-K9乙酰化水平的高低呈正相關。實驗完成后，采用凝膠成像分析儀拍照分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TSA 對人膀胱癌細胞EJ增殖的影響

MTT比色法檢測結果顯示，TSA處理24 h后，0.4、0.8和 1.6 μmol/L 濃度組人膀胱癌細胞 EJ的增殖抑制率高于空白對照細胞，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。TSA處理48 h后，0.2、0.4、0.8和1.6 μmol/L濃度組人膀胱癌細胞EJ的增殖抑制率均高于空白對照組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；處理 72 h后，0.1、0.2、0.4、0.8和 1.6 μmol/L人膀胱癌細胞EJ的增殖抑制率均高于空白對照細胞，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。人膀胱癌細胞EJ的增殖抑制率隨著TSA濃度的增加和TSA作用時間的延長而升高，存在一定的藥物濃度及時間依賴性。（表1）

表1 不同濃度TSA作用不同時間后人膀胱癌細胞EJ增殖抑制率的比較（%，±s）

2.2 TSA 對人膀胱癌細胞EJ細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，經0.8 μmol/L濃度的TSA處理72 h后，G/G期細胞的數量高于空白對照組，差異有統計學意義（

P

＜0.05）。經0.2、0.4和0.8 μmol/L濃度的TSA處理72 h后，S期細胞的數量均低于對照組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。經0.4、0.8 μmol/L濃度的TSA處理72 h后，G/M期細胞的數量高于對照組，差異有統計學意義（

P

＜0.05）。人膀胱癌細胞 EJ經 0.2、0.4和0.8 μmol/L濃度的TSA處理72 h后，G/G期、G/M期細胞的數量隨著TSA濃度的升高而逐漸增加，S期細胞的數量隨著TSA濃度的升高而逐漸減少。（表2）

表2 TSA處理72 h后對人膀胱癌細胞EJ細胞周期的影響（%，±s）

2.3 TSA 對人膀胱癌細胞EJ中WIF-1mRNA表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示，不同濃度（0.2、0.4和0.8 μmol/L）的TSA處理24、48、72 h后，與空白對照組比較，人膀胱癌細胞EJ中

WIF-1

mRNA的相對表達量均升高，差異均有統計學意義（

F

=64.332、336.948、457.151，

P

＜0.05）。經 0.4、0.8 μmol/L 的TSA處理72 h后，

WIF-1

mRNA的相對表達量明顯升高。（表 3）

表3 不同濃度TSA作用不同時間后人膀胱癌細胞EJ中WIF-1 mRNA相對表達量的比較（±s）

2.4 TSA對WIF-1基因啟動子區H3-K9乙酰化狀態的影響

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，電泳條帶符合預期的片段長度，未經TSA處理的人膀胱癌細胞EJ中未擴增出目的片段，經TSA處理后，人膀胱癌細胞EJ中擴增出目的片段，且隨著TSA濃度的增加，目的片段的產物增多，即

WIF-1

基因啟動子區的組蛋白H3-K9出現了乙酰化，且乙酰化水平隨著TSA濃度的增加而升高，呈一定的藥物濃度依賴性（圖1）。

圖1 ChIP 法分析不同濃度TSA 干預人膀胱癌細胞EJ后WIF-1基因啟動子組蛋白H3-K9的乙酰化水平

3 討論

近年來，表觀遺傳調控在腫瘤發生、發展中的作用備受關注。組蛋白修飾作為表觀遺傳調控的一種重要方式，不同組蛋白的不同氨基酸可以在不同位點發生不同類型的修飾，其中，以乙酰化為主。正常情況下，組蛋白乙酰化修飾在組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）和組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）的調控下維持動態平衡，保證相應基因的正常表達。研究發現，HDAC活性的增高可降低組蛋白的乙酰化水平，降低誘導細胞分化和凋亡的相關基因的表達水平，進而導致腫瘤發生。然而，HDAC抑制劑TSA可以通過抑制HDAC的活性，并提高特定組蛋白的乙酰化水平，從而提高或激活相應基因的表達水平，阻斷相關進程。

國內外研究發現，TSA在體外可抑制結腸癌、卵巢癌、宮頸癌、橫紋肌肉瘤等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。本研究采用MTT比色法觀察TSA對體外培養人膀胱癌細胞EJ生長的影響，證實不同濃度的TSA可明顯抑制人膀胱癌細胞EJ的增殖，且抑制作用具有一定的濃度和時間依賴性，表明TSA對人膀胱癌細胞EJ存在類似的抑制作用。本研究進一步使用流式細胞術檢測了TSA干預72 h后EJ細胞周期的變化情況，結果顯示，隨著藥物濃度的增加，G/G期和G/M期的細胞數目逐漸增多，而S期的細胞數目逐漸下降，表明TSA可將細胞阻滯于G/G期和G/M期。Wang等分析了不同濃度的TSA（125、250和500 nmol/L）處理膀胱癌細胞12、24 h后的細胞周期分布情況，結果顯示，隨著TSA濃度的升高，出現了G/M期阻滯和亞G峰（sub-G）形成，與本研究結果類似。

WIF-1是近年來發現的腫瘤抑制因子，其基因定位于染色體12q14.3上，全長約200 kb，可通過結合WNT蛋白抑制WNT通路的活性。大量研究證明，肺癌、宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌等惡性腫瘤中存在WIF-1的表達缺失或下調，最終導致WNT信號通路被異常激活，從而引起相應腫瘤發生。本研究通過實時熒光RT-PCR法發現，人膀胱癌細胞EJ中的WIF-1 mRNA呈低表達，而經TSA處理后，WIF-1 mRNA的表達水平明顯升高。研究發現，組蛋白H3-K9和組蛋白H4中第16位賴氨酸（histone H4 lysine 16，H4-K16）的乙酰化狀態與肺癌復發密切相關。為了解在膀胱癌中是否存在類似情況，本研究進一步利用染色質免疫沉淀技術檢測了人膀胱癌細胞EJ中WIF-1基因啟動子區H3-K9的乙酰化狀態，結果顯示，于TSA處理前，WIF-1基因啟動子區未發現組蛋白H3-K9的乙酰化，用藥后，組蛋白H3-K9出現乙酰化，且乙酰化水平隨著TSA濃度的增加而升高，與WIF-1 mRNA表達水平的變化趨勢一致。初步表明，TSA能夠改變WIF-1基因啟動子區組蛋白H3-K9的低乙酰化狀態，提高乙酰化水平，使WIF-1 mRNA的表達水平升高。

綜上所述，TSA可以在體外抑制人膀胱癌細胞EJ的增殖，其作用機制可能與細胞周期阻滯、WIF-1基因啟動子區組蛋白H3-K9乙酰化狀態改變、WIF-1基因表達水平提高有關，為更好地了解膀胱癌的發病機制和尋找新型治療藥物提供了一定的實驗依據。