MaFGF對慢性腦缺血再灌注損傷小鼠神經功能保護的機制研究

李燕 陳克龍 張妤婷 支海鴦 黎斌 孫慧靜 陳 凌*

缺血性腦卒中是最常見的一種具有較高的致殘率、致死率和復發率的腦血管疾病，且發病率逐年上升，呈年輕化趨勢［1］。及時恢復缺血區的血供以保護缺血半暗帶神經元是治療關鍵，但腦缺血后血管再通，可導致缺血再灌注損傷，引起缺血及其周圍神經細胞壞死和凋亡，加重腦缺血損傷。改構型酸性成纖維細胞生長因子（MaFGF）是一種多功效的生長刺激因子，具有調節神經、舒張血管、保護神經等多種生物學效應［2］。目前研究已證實MaFGF具有良好的抗腦缺血再灌注損傷作用［3］，但其對慢性腦缺血損傷神經保護的作用機制尚不明確。本研究通過觀察MaFGF對慢性腦缺血再灌注損傷小鼠PI3K/AKT信號通路及內質網應激凋亡通路相關蛋白的影響，探討MaFGF的神經保護功能及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 2～3月齡雄性C57BL/6J小鼠，體重22～25 g，購自上海斯萊克動物實驗中心，動物許可證號為SCXK（滬）2012-0002。MaFGF（暨南大學生物工程研究所），PI3K抗體（abcam，ab86714）、p-PI3K抗體（abcam，ab182651）、p-AKT抗體（abcam，ab38449）、AKT抗體（abcam，ab8805）、caspase-12抗體（abcam，ab62484）、CHOP抗體（abcam，ab11419）、GRP170抗體（abcam，ab241049），山羊抗小鼠IgG/TRITC（中杉金橋公司，貨號ZF-0313）紅光二抗、山羊抗小鼠IgG/FITC（中杉金橋公司，ZF-0312）綠光二抗，Morris水迷宮（上海吉量軟件科技公司），化學發光凝膠成像系統（北京東勝創新生物科技公司），熒光顯微鏡成像系統（OLYMPUS公司，DP72）。

1.2 建模與分組 24只雄性C57BL/6J小鼠飼養于SPF級動物房（室溫22±2℃，濕度50±5%）。按照隨機數字法將實驗小鼠分為Sham組、BCAO組和BCAO+MaFGF組，每組各8只。雙側頸動脈夾閉獲得腦缺血再灌注損傷模型：麻醉小鼠（10%水合氯醛），以仰臥姿勢固定于手術臺上，置于加熱毯上保持直腸溫度為37℃左右，同時保持呼吸順暢，在頸部腹側中線處常規消毒后做1 cm左右的切口，鈍性分離雙側頸總動脈，夾閉雙側頸總動脈約30 min，去除動脈夾恢復灌注，縫合切口；Sham組僅切開皮膚；再灌注后，BCAO+MaFGF組開始鼻內給藥20 μg/kg MaFGF，其余2組給予等體積的生理鹽水，1次/d，連續28 d。

1.3 神經功能評估 分別于術前/術后第28天，采用神經功能缺損評分（mNSS）評估所有實驗小鼠的神經功能損害程度，包括運動、感覺、反射、平衡試驗四個方面，分值為0～18分，小鼠無神經功能損傷體征則評為0分。

1.4 水迷宮測試 （1）定位航行試驗：所有小鼠在給藥結束后開始訓練，將平臺固定于目標象限的中央，圓池中注入清水（高出平臺約2～3 cm），在4個象限各取一點作為入水口并依次放入小鼠。記錄60 s內小鼠的運動軌跡及逃避潛伏期（從入水到爬上平臺的時間，上限為60 s）。每天在同一時間訓練小鼠，連續訓練5 d。（2）空間探索試驗：在訓練第6天，移除平臺，從4個相同入水點依次放入小鼠，觀察并記錄60 s內小鼠的運動軌跡及穿越原平臺位置次數，分析計算平均速度及在目標象限停留的時間百分比。

1.5 樣本采集與保存 取0.9%氯化鈉溶液心臟灌注排出腦組織血液，快速斷頭，取出全腦組織，放入液氮中速凍，用于后續蛋白測定及制備冰凍切片。部分小鼠繼以4%多聚甲醛心臟灌注直至小鼠全身僵硬，取出大腦浸入4%多聚甲醛液中固定，進行石蠟包埋，切片，低溫保存備用。

1.6 Nissl染色 取石蠟切片（片厚4 μm）進行常規脫蠟、水化、洗滌，加入甲苯胺藍溶液染色（60 ℃，40 min），隨后進行脫水（梯度乙醇）、透明（二甲苯溶液）、封片（透明樹脂），光學顯微鏡下觀察各種小鼠海馬CA1區神經元形態學變化。

1.7 免疫熒光染色 液氮速凍腦組織，切片機切片，片厚8 μm，35 ℃烘箱復溫5 min，4%多聚甲醛固定10 min，封閉液孵育30 min；將p-AKT、GRP170一抗稀釋液（1：100）混合后覆蓋各標本，置于濕盒內4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次；熒光二抗室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌；最后DAPI孵育5 min，PBS洗滌，抗熒光猝滅劑封片；熒光顯微鏡下，隨機選取5個視野，觀察各組小鼠大腦海馬CA1區神經元p-AKT及GRP170的表達及位置情況，并拍照。所有步驟均在黑暗中進行。

1.8 Western blot RIPA組織裂解液裂解海馬組織細胞，提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，制備蛋白樣品。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將各組蛋白樣品中不同分子大小的蛋白分離并轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉膜完成后脫脂奶粉室溫封閉1 h。隨后一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，滴加二抗稀釋液室溫孵育2 h，最后條帶滴加ECL化學曝光液，通過Bio-rad曝光機顯色曝光，采用ImageJ分析各蛋白灰度值，比較各組小鼠大腦海馬區p-PI3K、p-AKT、caspase-12、CHOP、GRP170的蛋白表達水平。

1.9 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的mNSS評分比較 各組小鼠術前mNSS評分均為0分，表明術前各組小鼠的神經功能均正常；術后Sham組小鼠評分為0分，BCAO組小鼠mNSS評分與Sham組比較明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；給予MaFGF治療后，BCAO+MaFGF組小鼠mNSS評分明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠認知行為能力比較 在定位航行試驗中，隨著訓練次數的增加，各組小鼠的逃避潛伏期逐漸降低。在訓練第3天，與Sham組比較，BCAO組小鼠逃避潛伏期明顯下降（P＜0.05）；與BCAO組比較，MaFGF組小鼠逃避潛伏期均明顯縮短（P＜0.05）。在空間探索試驗中，BCAO組小鼠平均穿越平臺次數與Sham組比較明顯減少（P＜0.05）；MaFGF組平均穿越平臺次數及60 s內在原平臺象限停留的時間百分比與BCAO組比較明顯增加（P＜0.05）。見圖2。

圖1 術后各組小鼠mNSS評分結果。與Sham組比較，★P＜0.05；與BCAO組比較，# P＜0.05

圖2 A 各組小鼠在定位航行試驗中訓練第5天的運動軌跡；B 各組小鼠在空間探索實驗中穿越平臺的運動軌跡；C 各組小鼠逃避潛伏期變化趨勢及空間探索實驗結果，包含平均速度（cm/s）、穿越平臺次數（times）和目標象限時間（s）；與Sham組比較，★ P＜0.05；與BCAO組比較，# P＜0.05

2.3 各組小鼠海馬CA1區神經元細胞形態結構的變化 Nissl染色顯示，Sham組小鼠海馬CA1區神經元細胞呈圓形或錐體形，細胞排列整齊，細胞核飽滿，核仁明顯，胞漿呈深藍色，內含豐富的尼氏體；與Sham組比較，BCAO組小鼠海馬CA1區神經元細胞排列紊亂、疏松，可見大量細胞結構破壞，細胞核固縮、碎裂，壞死細胞數目明顯增多（P＜0.05）；與BCAO組比較，BCAO+MaFGF組小鼠海馬CA1區正常神經元細胞增多，壞死細胞數目明顯減少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠海馬CA1區神經元細胞Nissl染色（×200）；與Sham組比較，★ P＜0.05；與BCAO組比較，# P＜0.05

2.4 各組小鼠海馬區p-PI3K、p-AKT、GRP170、CHOP、caspase-12蛋白表達水平比較 BCAO組小鼠海馬內CHOP和caspase-12與Sham組相比明顯升高（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、GRP170均未見明顯改變（P＞0.05）；經MaFGF處理后，CHOP和Caspase-12明顯降低，而p-PI3K、p-AKT、GRP170表達明顯增加（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組小鼠海馬CA1區p-PI3K、p-AKT、GRP170、Caspase-12、CHOP蛋白表達水平比較；與Sham組比較，★ P＜0.05；與BCAO組比較，# P＜0.05

2.5 各組小鼠海馬區p-AKT、GRP170免疫陽性顆粒的表達情況 p-AKT和GRP170免疫陽性顆粒均聚集在海馬神經元胞漿內；BCAO組小鼠海馬區p-AKT和GRP170免疫陽性顆粒表達量與Sham組比較差異無統計學意義；GRP170和p-AKT在BCAO+MaFGF組的分布均比BCAO組更趨致密。見圖5。

3 討論

酸性成纖維細胞生長因子（aFGF，FGF-1）是一種多功能生長刺激因子，因aFGF的特殊結構賦予其在血管再生、創傷修復、骨骼生長、神經保護等方面顯示出卓越的臨床應用價值，也成為了基礎研究領域的熱點［2］。但由于aFGF有絲分裂活性可能與細胞增殖、分化和腫瘤發生有一定的關系，使aFGF的應用受到一定限制。因此，本研究采用改構型aFGF觀察其對慢性腦缺血再灌注損傷小鼠的神經保護作用。aFGF的N端第21～27位的氨基酸Asn-Tyr-Lys-lys-Pro-Lys-Leu是aFGF促有絲分裂活性的重要氨基酸序列，定向敲除該段序列的第23～26位氨基酸片段，由Met取代Leu，可使其失去促有絲分裂能力，同時保留了非促分裂活性結構域［4］。XU等［3］研究表明MaFGF明顯減輕局灶性缺血再灌注大鼠的腦水腫程度和腦梗死面積，降低丙二醛含量，升高超氧化物歧化酶活性，對急性局灶性缺血再灌注大鼠發揮神經保護作用。本研究結果顯示，MaFGF可明顯降低BCAO組小鼠28 d時的mNSS評分，縮短逃避潛伏期，增加穿臺次數，表明MaFGF能夠改善慢性腦缺血再灌注損傷小鼠的神經功能和認知記憶力，發揮長期的神經保護作用。

圖5 各組小鼠海馬CA1區p-AKT、GRP170免疫陽性顆粒表達情況（×200）

腦缺血再灌注后，神經元細胞損傷主要表現為細胞凋亡，因此細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的中心環節和治療主要靶點。內質網應激（ERS）、鈣超載、氧化應激、炎性反應等諸多因素，均可導致細胞凋亡，其中內質網應激介導的細胞凋亡具有關鍵作用。當ERS過強或持續存在時，一方面內質網功能無法恢復，使細胞失衡轉向凋亡，一方面誘導激活增強劑結合蛋白同源蛋白（CHOP）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶12（Caspase12）等激活細胞凋亡通路，通過凋亡清除受損嚴重的細胞。本研究結果顯示，與Sham組比較，BCAO小鼠海馬CA1區CHOP、Caspase-12表達明顯升高，神經元細胞形態結構破壞嚴重，提示腦缺血再灌注損傷小鼠海馬神經元細胞存在內質網功能障礙。葡萄糖調節蛋白170（GRP170），是駐留在ER中的主要分子伴侶，與GRP78具有相似的調控作用。有文獻報道GRP170可以作為一種核苷酸交換因子（NEF），觸發結合免疫球蛋白（BiP）核苷酸轉錄形成ATP-BiP，除了其公認的NEF活性外，其還包含一個C端保持酶閾，能夠促進未折疊或錯誤折疊蛋白的降解，減輕內質網應激，從而起保護作用［5-6］。因此GRP170的高表達可以促進內質網功能的穩定，減少內質網應激相關細胞凋亡。本研究結果顯示，與Sham組比較，BCAO小鼠海馬區GRP170表達無明顯改變，這可能是在發生ERS初期，GRP170應激性增多以激活未折疊蛋白反應（UPR），恢復內質網的功能；但ERS持續存在，使得GRP170大量消耗而逐漸減少。aFGF可通過抑制內質網應激發揮神經保護作用，HU等［7］應用aFGF鼻內給藥1周持續治療新生兒缺血缺氧型腦損傷，可顯著減少腦梗死面積，通過抑制內質網應激發揮長期的神經保護作用。本研究結果顯示MaFGF可上調BCAO小鼠海馬區神經元細胞GRP170的表達，恢復內質網功能，降低CHOP、Caspase-12的表達水平，減少神經元凋亡。

FGF可通過與FGF受體結合，促使FGF受體磷酸化并產生酪氨酸蛋白激酶活性，啟動PI3K途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑、絲裂原活化蛋白酶（MAPK）途徑等發揮其生物學效應，其中PI3K/AKT通路是aFGF在神經組織中發揮作用的主要信號途徑［8-9］。外源性aFGF可通過激活PI3K-Akt-Rac1信號通路部分降低小分子G蛋白RhoA活性，從而改善腦外傷后的神經功能缺陷和保持血腦屏障完整性［10］。WANG等［11］研究發現bFGF可作用于靶細胞誘發PI3K信號通路級聯反應，激活下游ERK1/2、AKT、GSK3β通路，抑制內質網應激反應（ERS），從而減少神經組織病變和神經細胞凋亡。本研究顯示，MaFGF可增加BCAO小鼠神經元細胞PI3K、AKT的磷酸化，表明MaFGF可能是通過激活PI3K/AKT信號通路級聯反應而發揮抗凋亡作用。

綜上，MaFGF能夠明顯改善慢性腦缺血再灌注損傷小鼠的神經功能，改善認知和記憶能力，其可能機制是通過激活PI3K/AKT信號通路，減輕內質網應激，減少神經元細胞凋亡從而發揮神經保護作用。