基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的藍(lán)芩口服液治療新型冠狀病毒肺炎的分子機(jī)制研究

李研達(dá)，曾煜，劉旺

1.湛江市中心人民醫(yī)院內(nèi)科，廣東 湛江524000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 湛江524000

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)簡(jiǎn)稱“新冠肺炎”，在全球范圍內(nèi)爆發(fā)[1]。COVID-19被證實(shí)為一種主要經(jīng)飛沫或接觸傳播的急性呼吸道傳染病，其具有潛伏期長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)、人群普遍易感的特點(diǎn)[2]。雖然目前我國(guó)疫情已明顯好轉(zhuǎn)，確診病例增長(zhǎng)腳步明顯放緩，但近期在多地仍有少數(shù)本土確診病例被報(bào)道。國(guó)外疫情防控形勢(shì)相比較于我國(guó)更加嚴(yán)峻，尤其是美國(guó)、巴西等歐美國(guó)家，確診病例仍迅速增長(zhǎng)，其中意大利和西班牙的新冠肺炎總體死亡率更是超過(guò)10%，新冠肺炎已成為嚴(yán)重影響人類健康的社會(huì)問(wèn)題。目前我國(guó)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》指出，目前尚無(wú)針對(duì)新冠肺炎的特效藥物[3]，但中醫(yī)中藥憑借其在疾病中辨證論治方面的特點(diǎn)，不論是在以往的非典型肺炎還是如今我國(guó)防控新冠肺炎疫情方面都起到了重要的作用。

藍(lán)芩口服液是由板藍(lán)根、黃柏、黃芩、胖大海、梔子等中藥組合而成的中藥制劑，由于其具有抗病毒、清熱解毒、消炎止痛等作用，目前已在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療上呼吸道感染、慢性咽炎等多種疾病中[3]。《廣東省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥治療方案(試行第二版)》推薦藍(lán)芩口服液用于疑似病例及早期確診病例的治療[4]。板藍(lán)根具有清熱解毒、消炎利腫的功效，能在體內(nèi)阻斷病毒復(fù)制和繁殖，具有明確的抗病毒功能[5]。黃柏味苦、性寒，有清熱、燥濕、解毒、療瘡之功，并且對(duì)包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種細(xì)菌有抑制作用[3]。黃芩味苦、性寒，有瀉火、解毒、止血、安胎之功效，可在體內(nèi)抑制腺病毒及流感病毒的復(fù)制及播散[6]。胖大海味甘、性涼，現(xiàn)代藥理學(xué)表明其具有抗病毒、抗炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)菌繁殖的作用，并且可增強(qiáng)脾臟及胸腺的功能，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[7]。梔子味苦、性寒，有清熱、瀉火、涼血之功效，在抑制炎癥滲出、抗金黃色葡萄球菌、鎮(zhèn)痛等多個(gè)方面均發(fā)揮作用[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在傳統(tǒng)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上整合計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)科學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科的一門新興學(xué)科，其主要強(qiáng)調(diào)藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)，從整體上探索藥物與機(jī)體之間的相互作用關(guān)系，反映了多組分、多靶點(diǎn)和系統(tǒng)調(diào)控的思想，與中醫(yī)中藥的辨證論治和整體觀念有著相似之處[9]。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索藍(lán)芩口服液治療COVID-19的分子機(jī)制，為COVID-19治療藥物的研發(fā)和臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 藍(lán)芩口服液主要活性成分篩選TCMSP(http://tcmspw.com/index.php)是一個(gè)可用于探索藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系的中草藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以藍(lán)芩口服液的主要5味中藥藥材板藍(lán)根、黃柏、黃芩、胖大海、梔子為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18及半衰期(half-Life，HF)≥4為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選藍(lán)芩口服液的主要活性成分。

1.2 藍(lán)芩口服液主要活性成分作用基因靶點(diǎn)及COVID-19相關(guān)基因靶點(diǎn)收集Related Targets功能是TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的功能之一，可用于預(yù)測(cè)得到的藍(lán)芩口服液的主要活性成分的作用靶點(diǎn)信息，使用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分作用靶點(diǎn)信息進(jìn)行校正及標(biāo)準(zhǔn)化得到對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)[11]。使用GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)[12]，以“Novel coronavirus pneumonia”為檢索詞，檢索得到新型冠狀病毒肺炎的相關(guān)基因靶點(diǎn)。對(duì)藍(lán)芩口服液主要活性成分作用基因靶點(diǎn)及疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)使用韋恩圖取交集得到共同基因靶點(diǎn)，此共同基因靶點(diǎn)即為藍(lán)芩口服液治療COVID-19的基因靶點(diǎn)。

1.3 藥材-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與共同基因靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將板藍(lán)根、黃柏、黃芩、胖大海、梔子這五味中藥與其主要活性成分及相關(guān)作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscpe 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)[13]軟件中，構(gòu)建藥材-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將“1.2”中韋恩圖得到的共同基因靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)[14]數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建共同基因靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 共同基因靶點(diǎn)GO與KEGG通路富集分析DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)是對(duì)基因功能進(jìn)行注釋的常用數(shù)據(jù)庫(kù)，使用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)[15]數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，對(duì)共同基因靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P＜0.01和富集的基因counts＞5為截?cái)嘀禈?biāo)準(zhǔn)，以進(jìn)一步了解藍(lán)芩口服液治療COVID-19的分子信號(hào)通路。GO分析由三個(gè)方面組成，分別是生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，是對(duì)基因的本質(zhì)進(jìn)行闡述。KEGG通路富集分析有助于了解某一基因或者某一蛋白質(zhì)所參與信號(hào)通路過(guò)程及其在信號(hào)通路過(guò)程中所處的地位。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)芩口服液的主要活性化合物 本研究通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18及HL≥4為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選得到藍(lán)芩口服液的主要活性成分104種，其中板藍(lán)根30種，黃柏27種，黃芩32種，胖大海4種，梔子11種，去除重復(fù)項(xiàng)后共得到91種主要活性成分。各活性成分以O(shè)B值按大小排序，使用表格對(duì)OB值排名前20的活性成分進(jìn)行展示，如表1所示。

2.2 藍(lán)芩口服液主要活性成分作用靶點(diǎn)及疾病相關(guān)靶點(diǎn) 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藍(lán)芩口服液主要活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，經(jīng)過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)相關(guān)作用靶點(diǎn)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和基因名稱注釋及去除重復(fù)值后，共得到205個(gè)作用基因靶點(diǎn)，其中作用靶點(diǎn)數(shù)目排名前5的活性成分分別為MOL000098-quercetin(槲皮素)、MOL000358-beta-sitosterol(β-谷甾醇)、MOL000449-Stigmasterol(豆甾醇)、MOL000422-kaempferol(山奈酚)、MOL000173-wogonin(漢黃芩素)。新冠肺炎相關(guān)基因靶點(diǎn)信息通過(guò)使用Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Novel coronavirus pneumonia”為檢索詞檢索得到，共得到疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)259個(gè)。使用韋恩圖將活性成分作用基因靶點(diǎn)與COVID-19相關(guān)基因靶點(diǎn)取交集后得到共同基因靶點(diǎn)43個(gè)即為藍(lán)芩口服液治療COVID-19的基因靶點(diǎn)，如圖1所示。

圖1 藍(lán)芩口服液治療COVID-19基因靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 構(gòu)建靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape

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3.7.2 軟件對(duì)板藍(lán)根、黃柏、黃芩、胖大海、梔子這五味中藥藥材及其活性成分、作用靶點(diǎn)構(gòu)建藥材-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含282個(gè)節(jié)點(diǎn)和1272條邊(5個(gè)中藥藥材節(jié)點(diǎn)，74個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)，205個(gè)基因靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))，其中黃色三角形代表板藍(lán)根(Isatidis Radix)、黃柏(Phellodendri Chinrnsis Cortex)、黃芩(Scutellariae Radix)、胖大海(Sterculiae Lychnophorae Semen)、梔子(Gardeniae Fructus)這五味中藥藥材，綠色六邊形代表各中藥藥材所對(duì)應(yīng)的主要活性成分，藍(lán)色圓形代表五味中藥藥材的共同活性成分，紅色菱形代表205個(gè)基因靶點(diǎn)(圖2)。使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)“2.2”中得到的藍(lán)芩口服液治療COVID-19的基因靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)，PPI網(wǎng)絡(luò)中共包含43個(gè)節(jié)點(diǎn)和513條邊，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白，每條邊代表靶點(diǎn)蛋白與其他靶點(diǎn)蛋白間的相互作用關(guān)系。度值可反應(yīng)某個(gè)靶點(diǎn)蛋白與其他靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系的強(qiáng)弱從而提示靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位，在PPI網(wǎng)絡(luò)中，度值排名前10的靶點(diǎn)分別為：絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、白介素6(interleukin 6，IL6)、胱天蛋白酶3(Caspase 3，CASP3)、白介素10(interleukin 10，IL10)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、CXC趨 化 因 子 配 體8(C-X-C motif chemokine ligand，CXCL8)、CC型修飾趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2，CCL2)、白介素1B(interleukin 1B，IL1B)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、干擾素γ(Interferon-gamma，IFNG)，藍(lán)芩口服液很有可能通過(guò)作用于這些靶點(diǎn)在治療COVID-19中發(fā)揮作用。

2.4 共同基因靶點(diǎn)的功能富集分析 本研究中使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.01和富集的基因counts＞5為截?cái)嘀禈?biāo)準(zhǔn)，對(duì)GO每個(gè)富集項(xiàng)目中富集基因數(shù)目排名前5的注釋條目使用柱狀圖進(jìn)行可視化(圖4)，對(duì)KEGG通路富集分析中富集基因數(shù)目排名前20的注釋條目使用柱狀圖進(jìn)行可視化(圖5)。GO富集分析顯示，共同基因靶點(diǎn)在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能這三個(gè)方面富集的條目分別是30、10、7，其中包括了炎癥反應(yīng)、藥物反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凋亡過(guò)程、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶的結(jié)合等多個(gè)方面，提示藍(lán)芩口服液可能通過(guò)參與多個(gè)生物學(xué)途徑的調(diào)節(jié)對(duì)COVID-19的治療產(chǎn)生影響。KEGG通路富集分析顯示共同基因靶點(diǎn)富集在包括癌癥通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路在內(nèi)的59個(gè)KEGG信號(hào)通路。

圖2 藍(lán)芩口服液中藥材-活性成分-作用基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 藍(lán)芩口服液藍(lán)芩口服液治療COVID-19靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 藍(lán)芩口服液治療COVID-19基因靶點(diǎn)GO富集分析

圖5 藍(lán)芩口服液治療COVID-19基因靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討論

COVID-19因具有潛伏期長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)、傳播迅猛的特點(diǎn)，在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“疫病”范疇[3]。自古以來(lái)我國(guó)對(duì)于疫病的病因、病機(jī)、防控及治療等方面有著較為完善的理論體系，一代代醫(yī)家學(xué)者在通過(guò)不斷探索與實(shí)踐，在疫病診療的各個(gè)方面都積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。有臨床研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療COVID-19能減輕患者的臨床癥狀，縮短疾病病程，提高治愈率的特點(diǎn)[16]。

在《廣東省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥治療方案(試行第二版)》中，對(duì)于新冠肺炎的病因病機(jī)，可總結(jié)為以肺為病變之重心，可輻射至脾、腎、胃等多個(gè)器官，其病機(jī)特點(diǎn)為熱、濕、瘀、毒、虛，在該方案中藍(lán)芩口服液被推薦用于以外感發(fā)熱為主要癥狀的疑似病例及以乏力、咽痛、口干、干咳少痰等為主要臨床表現(xiàn)的早期確診病例中[3]。因此，本研究試圖通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步挖掘藍(lán)芩口服液的主要活性成分及其在治療COVID-19中的分子機(jī)制。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，共篩選出藍(lán)芩口服液中主要活性成分91種以及相對(duì)應(yīng)的作用基因靶點(diǎn)205個(gè)，其中作用靶點(diǎn)數(shù)目排名前5的活性成分分別為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、漢黃芩素。槲皮素是一種黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，槲皮素在抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤及降糖、降脂等多個(gè)方面均有重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制包括IL6、IL10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)還可通過(guò)鈣穩(wěn)態(tài)途徑抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子的釋放，從而在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[18]。漢黃芩素也是一種黃酮類化合物，在體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)度激活中有著抑制作用，對(duì)于甲型流感病毒所致的急性肺損傷具有改善作用[19]。研究表明β-谷甾醇在抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多方面具有重要作用，還可以通過(guò)抑制TNF-α-NF-κB信號(hào)通路起到改善肝臟纖維化、保護(hù)肝功能的作用[20]。山奈酚同樣是一種具有抗炎、抗菌、抗病毒等多種功效的黃酮類化合物，在抗菌、抗病毒方面，有研究報(bào)道了山奈酚對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)、霍亂弧菌、乙型肝炎病毒均有抑制作用，同時(shí)亦可通過(guò)抑制炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮著抗炎癥反應(yīng)的作用[21]。

在藍(lán)芩口服液治療COVID-19的基因靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中，MAPK8、IL6、CASP3、IL10、MAPK1、CXCL8、CCL2、IL1B、PTGS2、IFNG處于核心地位可能是藍(lán)芩口服液治療COVID-19的主要作用靶點(diǎn)，其中IL6、IL10、IL1B與炎癥反應(yīng)相關(guān)，MAPK8與MAPK1是MAPK家族成員，可在癌癥、病毒感染等多種應(yīng)激條件下被激活，從而產(chǎn)生逐級(jí)磷酸化，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面發(fā)揮作用[22]。CCL2、CXCL8均屬于趨化因子家族成員，同時(shí)CCL2與CXCL8又都屬于炎性趨化因子，在炎癥反應(yīng)中有著重要作用[23]。CCL2在免疫調(diào)節(jié)中起到調(diào)控巨噬細(xì)胞的吞噬作用及調(diào)控T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的作用[24]。有研究表明，CCL2可通過(guò)促進(jìn)HIV-1病毒的復(fù)制進(jìn)而促進(jìn)了艾滋病的發(fā)展[25]。

通過(guò)對(duì)藍(lán)芩口服液治療COVID-19的基因靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析，可以觀察到，藍(lán)芩口服液治療COVID-19涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和分子信號(hào)通路，提示了藍(lán)芩口服液在治療COVID-19中有著多靶點(diǎn)調(diào)控，多方面作用的特點(diǎn)。其中KEGG富集分析結(jié)果顯示，藍(lán)芩口服液主要活性成分作用基因靶點(diǎn)參與了癌癥通路、南美錐蟲(chóng)病、甲型流感通路、肺結(jié)核通路、TNF信號(hào)通路、乙型肝炎通路、HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等信號(hào)通路，不難發(fā)現(xiàn)，上述通路涉及了病毒感染、細(xì)菌感染、免疫調(diào)控、炎癥反應(yīng)等多個(gè)方面。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度，篩選與分析了藍(lán)芩口服液治療COVID-19的相關(guān)作用靶點(diǎn)及其相關(guān)分子信號(hào)通路，說(shuō)明了藍(lán)芩口服液在治療COVID-19上有著多靶點(diǎn)調(diào)控、多方面作用的特點(diǎn)。在藍(lán)芩口服液中，5味主要中藥材均屬性寒、性涼一類的藥材，如長(zhǎng)期或大量服用可傷脾胃，故在治療COVID-19時(shí)應(yīng)注意辨證論治，同時(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有著一定的局限性，后續(xù)應(yīng)對(duì)各藥材的主要活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)、信號(hào)通路做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而為后期COVID-19藥物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。