MicroRNA-155在原發性免疫性血小板減少癥患兒外周血單個核細胞中的表達及意義

散琴，崔瑩瑩，柯盈月

十堰市婦幼保健院檢驗科，湖北 十堰442000

原發性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)屬于臨床上較為常見的一種出血性疾病，亦是免疫性綜合病癥之一[1]。其主要臨床特征為血液循環內存在一定量的抗血小板抗體，從而導致血小板損害明顯，引發紫癜，且骨髓內的巨核細胞正常或增多，幼稚化，進一步促進血小板減少[2]。迄今為止，關于原發性ITP的具體病因以及發病機制尚未徹底明確，近年來研究發現自身免疫功能異常可能在該病的發生、發展過程中起著至關重要的作用[3]，其中自身免疫功能的異常可能引起患兒產生抗血小板抗體，進一步破壞大量血小板，繼而導致血小板的減少，引起B細胞過度活化產生抗體，而后輔助性T細胞對其進行免疫應答，最終引起免疫紊亂并產生細胞毒性[4-5]。MicroRNA-155轉錄源自21號染色體B細胞整合簇區域，和B淋巴細胞分泌自身抗體密切相關，可在一定程度上影響B淋巴細胞功能[6]，因而MicroRNA-155與ITP的發病可能存在關聯。鑒于此，本文通過研究MicroRNA-155在原發性ITP患兒外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中的表達，并分析其與血小板計數(platelet count，PLT)、細胞因子及T淋巴細胞亞群的關系，旨在初步探明MicroRNA-155在ITP發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取十堰市婦幼保健院2015年2月至2019年6月收治的83例原發性ITP患兒納入研究(病例組)。納入標準：(1)診斷參考《血液病診斷及療效標準》[7]中ITP相關診斷標準；(2)入院前尚未接受ITP相關治療；(3)無臨床病歷資料缺失。排除標準：(1)因糖尿病、藥物以及自身免疫疾病導致的繼發性ITP患兒；(2)心、肝、腎等重要臟器受損的患兒；(3)正參與其他研究的患兒。病例組患兒中男性46例，女性37例；年齡4個月～10歲，平均(4.96±2.12)歲。另選取同期到我院體檢的健康兒童80例作為健康組，其中男性45例，女性35例；年齡4個月～11歲，平均(4.79±2.10)歲。兩組受檢者的上述指標比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。入組兒童的監護人均對研究知情，并在同意書上簽字，研究過程嚴格遵守《赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 觀察指標與檢測方法

1.2.1 PBMC中MicroRNA-155表達水平的檢測 病例組患兒入院次日、健康組兒童體檢當日采集外周靜脈血5 mL，以Ficoll-Hypaque密度梯度法離心分離PBMC，用含2%的胎牛血清磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入TRIzol試劑后提取PBMC中總RNA，具體操作務必以試劑盒說明書為準。使用MicroRNA特異的引物及反轉錄試劑盒反轉錄為互補DNA，利用RNA分離試劑盒提取樣品中的總RNA，采用紫外分光光度計測定RNA樣品于260 nm以及280 nm處的吸光度，若吸光度在1.8～2.0內說明RNA純度良好，隨后逆轉錄成cDNA。條件為42℃反應1 h，70℃反應10 min。使用TaqMan MicroRNA檢測試劑盒(Applied Biosystems)進行RT-PCR檢 測miR-155相對表達量。反應條件為95℃預變性40 s、95℃變性5 s、60℃反應0.5 min，每個設置含3個平行，總共循環40次。MicroRNA-155引物序列如下：正向：5'-GCGGCGGTTAATGCTAATCGTG-3'，反 向：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAG-3'；以U6作為內參，對照物引物序列為：正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。根據Ct值以及通過2-△△Ct方法計算miR-155相對表達量。每個樣本做3個重復，取平均值。

1.2.2 PLT、細胞因子及T細胞亞群的檢測 取其余三份血樣，分裝于A、B、C三管，A管采用國產全自動血液分析儀(型號BC-6800)進行PLT的檢測；B管血樣經3 000 r/min離心10 min后取上清進行細胞因子的檢測：細胞因子主要包含干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，以酶聯免疫吸附法完成檢測，具體操作務必遵循試劑盒說明書進行(武漢博士德生物科技有限公司)。C管血樣應用流式細胞儀檢測T細胞亞群水平，主要指標為Th1、Th17、Th2、Treg，具體操作務必以儀器相關說明書進行。

1.3 統計學方法 應用SPSS24.0軟件對研究數據進行統計分析。計數資料比較采用χ2檢驗；計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗；采用Pearson相關性分析PBMC中MicroRNA-155表達量與PLT、細胞因子、T細胞亞群的關系。檢驗水準為α=0.05，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者PBMC中MicroRNA-155相對表達量及PLT水平比較 病例組患兒PBMC中MicroRNA-155相對表達量明顯高于健康組，且PLT水平明顯低于健康組，差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 兩組受檢者PBMC中MicroRNA-155表達量及PLT水平比較(±s)

表1 兩組受檢者PBMC中MicroRNA-155表達量及PLT水平比較(±s)

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2.2 兩組受檢者的血清細胞因子水平比較 病例組患兒的血清IFN-γ、IL-2水平明顯高于健康組，而IL-4、IL-10水平明顯低于健康組，差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)，見表2。

表2 兩組受檢者的血清細胞因子水平比較(±s，pg/mL)

表2 兩組受檢者的血清細胞因子水平比較(±s，pg/mL)

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2.3 兩組受檢者的T細胞亞群比較 病例組患兒的Th2、Treg水平明顯低于健康組，Th1水平明顯高于健康組，差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)，但兩組的Th17水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 兩組受檢者的T細胞亞群比較(±s，%)

表3 兩組受檢者的T細胞亞群比較(±s，%)

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2.4 PBMC中MicroRNA-155相對表達量與PLT、細胞因子、T細胞亞群的相關性Pearson相關性分析結果顯示：PBMC中MicroRNA-155相對表達量與PLT、IL-4、IL-10、Treg、Th2水平均呈負相關(P＜0.05)，而與IFN-γ、IL-2、Th1水平均呈正相關(P＜0.05)，與Th17無明顯相關性(P＞0.05)，見表4。

表4 PBMC中MicroRNA-155相對表達量與PLT、細胞因子、T細胞亞群的相關性

3 討論

ITP作為臨床多見的自身免疫性出血性疾病之一，其發病原因以及機制仍處于探索階段，因此臨床上尚無治療ITP的特異性手段[8-9]。目前有研究認為ITP可能和T細胞亞群紊亂有關，如Th1、Th2細胞的平衡紊亂與ITP的發病有關，Treg細胞的免疫調節失衡導致ITP病情加重[10]，Th17細胞作為新發現的T細胞亞群，其與自身免疫病存在較為明顯的聯系[11]。近年來的研究發現ITP患者體內多種細胞以及體液中存在多種MicroRNA表達異常現象[12-13]，提示MicroRNA表達異常可能參與了ITP的發生、發展過程。MicroRNA-155屬于MicroRNA家族成員之一，隨著其表達逐漸升高，機體B細胞會被過度激活，進一步合成、分泌大量特異性抗體，從而導致機體免疫系統亢進的發生，繼而促進了免疫性疾病的發生[14-15]。另有相關研究報道證實，MicroRNA-155在系統性紅斑狼瘡以及重癥肌無力等一系列自身免疫性疾病中均存在異常表達[16-17]。由此，本文通過檢測MicroRNA-155在ITP患兒PBMC中的表達水平，旨在初步探討其在ITP發病機制中的作用。

本文結果發現，病例組PBMC中MicroRNA-155相對表達量顯著高于健康組，PLT低于健康組，提示了MicroRNA-155在ITP患兒PBMC中存在明顯高表達，且可能參與了ITP的發生、發展過程。分析原因為B淋巴細胞內的MicroRNA-155可能是通過對自身反應性B細胞產生過度激活作用，繼而促進IgG以及IgM等特異性抗體的合成與分泌，參與血小板的破壞，最終引發ITP的發生，這與郭瑩等[18]的研究報道相吻合。此外，ITP的發生可能和原發感染導致的長期免疫應答異常有關，從而促進了免疫球蛋白和血小板表面抗原的結合，進一步誘導自然殺傷細胞NK進行外毒素分泌型的細胞毒性作用損傷血小板，最終導致PLT的明顯下降。IFN-γ、IL-2主要是由Th1細胞分泌，主要作用是直接殺傷抗原遞呈細胞或活化殺傷性細胞，繼而參與細胞免疫的調節；而IL-4、IL-10主要是由Th2細胞分泌而來，可直接抑制殺傷性細胞或促進B淋巴細胞分化增殖產生抗體，進一步參與體液免疫。本研究結果顯示病例組血清IFN-γ、IL-2水平顯著高于健康組，而IL-4、IL-10水平均顯著低于健康組，這提示了Th1、Th2細胞失衡可能參與了ITP的發生、發展過程。究其原因，IFN-γ、IL-2分泌增加會導致免疫環境紊亂，影響CD4+T細胞增殖分化為Th2類細胞，從而減少了Th2類細胞因子的產生；而IL-4、IL-10可抑制CD4+T細胞增殖分化為Th1類細胞，導致Th1分泌的細胞因子減少，正常生理狀態下二者處于動態平衡[19-21]，而隨著IFN-γ、IL-2水平的升高以及IL-4、IL-10水平的降低，勢必導致Th1增加，Th2減少，引起Th1、Th2細胞失衡，進一步促進大量血小板抗體的生成，同時激活了單核-巨噬細胞的吞噬功能，導致大量被致敏的血小板被吞噬消滅，最終引發了ITP[22]。這在王瑩等[23]的研究報道中得以佐證：ITP患兒存在明顯的T淋巴細胞亞群失衡，且存在不同程度的細胞因子紊亂。然而，上述研究分析了不同年齡階段ITP患兒的細胞因子表達水平差異，而本研究并為進行該方面的研究，這為我們今后的研究提供了新的方向。另外，Pearson相關性分析顯示PBMC中MicroRNA-155表達量與PLT、IL-4、IL-10、Treg、Th2水平均呈負相關關系，而與IFN-γ、IL-2、Th1水平均呈正相關關系，初步說明MicroRNA-155可能是通過影響IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-2的合成與分泌，進而對患兒的免疫系統造成影響，進一步介導ITP的發生、發展，但其具體的影響機制尚待日后進一步探討明確。然而，本研究尚且存在樣本量較少的缺陷，可能導致研究結果發生偏頗，值得臨床重點關注。

綜上所述，ITP患兒的PBMC中MicroRNA-155存在明顯高表達，且與PLT、IL-4、IL-10、Treg及IFN-γ、IL-2、Th1、Th2水平均具有一定的相關性，可能通過影響免疫系統參與了ITP的發病過程，具有作為ITP患兒治療靶點的潛力。