消毒技術在非洲豬瘟防控中的應用現狀與問題

王巍, 羅玉子, 張麗, 馬吉飛, 仇華吉*

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所， 獸醫生物技術國家重點實驗室， 哈爾濱 150069；2.天津農學院動物科學與動物醫學學院, 天津 300384)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)感染引起豬的一種烈性傳染病。目前該病尚無商品化的疫苗和有效的治療藥物[1]，已經給全球養豬業造成了巨大的經濟損失。ASFV屬于蟲媒DNA病毒，是非洲豬瘟相關病毒科、非洲豬瘟病毒屬的成員[2-4]，對環境的抵抗力強，傳染源眾多且傳播途徑廣泛，嚴格的生物安全措施是目前防控該病最有效的手段，其中最重要的環節是消毒和檢測。

ASF消毒效果不佳是導致疫情未得到有效控制的重要原因。此外，檢測技術也是防控ASF的重要手段，由于目前的分子及免疫學檢測技術僅能測定樣品中是否存在病毒的核酸或抗原，無法確定其感染性，因此也無法對消毒效果進行快速評價。1960年，Malmquist等[5]建立紅細胞吸附試驗，其原理是感染ASFV的豬外周血單核細胞或組織巨噬細胞能吸附在紅細胞表面形成“玫瑰花環”，根據該特性可鑒別具有感染性的ASFV。但該方法耗時、成本高,僅適用于專業實驗室進行確診，不適用于常規、快速檢測，也不適用于非血細胞吸附毒株的診斷。本文針對目前ASF的滅活方法進行了總結和分析，同時對快速鑒別感染性及失活的ASFV檢測技術探索提出了新見解，以期為該病生物安全防控中消毒劑的正確選擇和使用、ASFV消毒效果的快速評價以及現地防控提供參考。

1 ASFV消毒技術簡介

目前常見消毒方式主要分成4大類：化學、物理、生物以及環境生態修復法。每種消毒方式的作用機理、適用范圍和優缺點等各不相同(表1)。對各類常見消毒方式的原理和特點予以概述，以期為ASFV的滅活提供參考。

1.1 化學消毒劑

化學消毒劑主要包括醛類、鹵素類等化學制劑，具有廣譜性消毒效果。其中，醛類消毒劑能破壞病毒的囊膜結構，還可與DNA相互作用，干擾蛋白質-DNA交聯代謝[6]。這類消毒劑具有潛在的致癌、致突變[7]和致呼吸道過敏反應的風險[8]。鹵素類消毒劑包括氯、碘、氟、溴、砹5種元素以及它們與金屬離子形成的化合物(鹽類)。其主要通過滲透膜并氧化蛋白質，中斷氧化磷酸化過程滅活病毒。其性狀溫和、抗有機物能力很強[8]，但穩定性較差。氧化物及過氧化物類消毒劑能氧化包膜蛋白，使病毒包膜通透性增加，內容物外流從而失去活性。其作用時間短且不留殘余毒性，但氧化能力易受到溫度和酸堿度的影響[9]。酚類及苯酚衍生物能使蛋白質變性和凝固從而引起膜損傷。這類消毒劑性狀穩定但具有腐蝕性，其消毒效果易受堿性物質影響[10]。堿類消毒劑屬于單組分高效消毒劑。其在水溶液中解離的大量氫氧根離子能溶解ASFV的囊膜結構，其殺滅效果隨氫氧根離子的濃度的增加而增強[9]。這類消毒劑極易受潮且安全性較差[10]。季銨化合物類消毒劑按照其結構組成特點可歸納為單鏈季銨鹽、雙鏈季銨鹽、聚季銨鹽、混合季銨鹽4大類。單鏈季銨鹽的烷烴鏈可與病毒包膜類脂層發生疏水相互作用而插入其中,導致酶失活和蛋白質變性[11]。雙鏈季銨鹽能結合到病毒包膜上影響新成代謝，干擾核酸和蛋白質合成，影響能量代謝[12]。使用時應避免與陰離子表面活性劑(肥皂、吐溫80)和一些拮抗物質(碘化鉀、蛋白銀、水楊酸、升汞)同時使用[13]。

含碘消毒劑包括碘和以碘為主要成分的各種制劑，碘主要通過鹵化作用與ASFV蛋白質氨基結合，使其失活[14]。它的消毒效果易受pH和有機物影響。

1.2 物理消毒法

紫外線能使病毒核酸內鍵和鏈發生斷裂、形成光化產物等，其穿透力弱、輻射能量低，對人體有刺激和損傷作用，嚴重時可致癌。γ射線對分子的損傷主要源于初級電離(直接)和自由基的產生(間接)[15]，其穿透力強、滅活速度快且不影響病原微生物的抗原性和免疫原性[16]。

1.3 生物消毒法

生物消毒劑是指用生物分泌的化學物質，如植物消毒劑、抗菌肽、噬菌體、生物酶等制備的消毒劑[17]。

1.4 環境生態修復法

環境生態修復是通過創造不利于病原微生物生存的條件來凈化和修復環境。生態修復劑主要由微生物菌體和微量化學元素組成[18]，其掉落地面形成的生物膜在物體表面發酵能消耗有機物和氧氣[19]。這類消毒劑可在環境中穩定長效，具有很好的發展前景。

1.5 其他病毒清除技術

低 pH 孵放法是靜脈注射人免疫球蛋白常用的病毒滅活方法，已有很多研究者對其滅活效果進行了驗證[20-21]。低pH可改變病毒表面的抗原電荷，使其囊膜結構發生變性從而無法侵染細胞。

表1 ASFV主要消毒方式的特點及推薦消毒劑效果評價方法Table 1 Characteristics of main disinfection methods of ASFV and evaluation methods of recommended disinfectant effectiveness

它的特點是安全、高效且穩定。

納濾(nanofiltration, NF)又稱低壓反滲透或“疏松反滲透”(loose)，是一種介于反滲透和超濾之間的壓力驅動膜分離過程，納濾膜的孔徑范圍在幾個納米左右，能去除二價及多價離子和分子量大于200的各類物質[22]。

陰離子交換色譜(anion-exchange chromatography, AEX)是根據混合物中不同分子所帶電荷性質的差異進行分離的一種色譜技術, 根據該原理也可用于樣品中病毒的純化或清除[23]，其特點是操作簡單、條件溫和、重復性強。

2 不同消毒技術在疫病防控中的應用

2.1 化學消毒法在在疫病防控中的應用

2.1.1醛類1979年，Cunliffe等[24]發現，戊二醛能有效滅活暴露于22～26 ℃ 11 d的豬心臟組織中的ASFV。某醛制劑產品(12.74%戊二醛+ 4.84% 癸甲氯銨)于20 ℃作用30 min，稀釋比例為1∶50，可使含1%有機物的磷酸緩沖液(PBS)中的ASFV滴度降低4.6 log，其在高溫下的作用效果較好[25]。現地常用500 mL 40%的福爾馬林與200 g高錳酸鉀混合對封閉畜舍進行熏蒸消毒，時間為24 h，熏蒸后開窗通風8 h[26]。

2.1.2鹵素類研究顯示2.3%的氯(次氯酸鹽)作用30 min能有效滅活ASFV[27]。豬場常用5%的次氯酸鈉溶液噴灑至地面、墻壁、通道、排污溝、用具和設備等，包括漏縫地板背面等物體表面徹底濕潤，2 h后再噴灑1次，4 h后用清水沖洗，自然干燥2～3 d[26]。

2.1.3氧化物及過氧化物類近期研究發現，5 mg·L-1臭氧水能有效殺滅ASFV[28]，其殺滅效果受到臭氧分子向液體中轉移總速率的限制[29-30]。衛可消毒劑(VirkonS)[31]的有效成分是過硫酸氫鉀三鹽復合物，1%的衛可作用10 min能完全滅活不銹鋼表面3.2 log10 TCID50·mL-1的ASFV，5%的衛可作用10 min能完全滅活多孔混凝土中的ASFV[32]。現地常將1% 過硫酸氫鉀溶液噴灑于環境物體表面，作用2 h后再噴灑1次，4 h后用清水沖洗，自然干燥2～3 d[26]。

2.1.4酚類1%鄰苯酚能有效滅活ASFV，最短滅活時間為1 h[33]。苯酚對有機物具有良好的滲透力，主要用于含有機物質(如感染食物和排泄物等)的場所消毒。

2.1.5堿類2%的碳酸鈉腌制28 d能有效滅活生皮中的ASFV。2%氫氧化鈉24 h內能殺死血液中ASFV[34]。豬場常采用3%的NaOH溶液對畜舍噴灑消毒1～2次，4 h后用清水沖洗，干燥3～5 d 后用5% NaOH+20%的石灰水進行白化處理[26]。

2.1.6季銨鹽類近期研究發現，單雙鏈季銨鹽復配使用能大幅增加抗有機物能力，其主要用于環境表面ASFV的消毒[35]。

2.1.7碘制劑類消毒劑碘制劑抗有機物能力差，不適用于環境消毒，常用于手術部位、皮膚、粘膜消毒以及發生疫情時帶豬、帶禽消毒[12]。近期研究發現，三碘氧化合物能克服傳統碘制劑抗有機物能力差的缺陷[36]。

2.2 物理消毒法在疫病防控中的應用

2.2.1高溫消毒ASFV高度耐低溫不耐高溫。Mazur等[37]根據非線性回歸模型估計半衰期值，預測ASFV在-20 ℃能存活353～713 d，4 ℃能存活35～136 d，23 ℃能存活9～17 d。實驗室條件下，100 ℃持續1 min可徹底滅活106TCID50·mL-1病毒懸液，火焰溫度下可瞬間滅活ASFV。現地由于高溫滅活效果會受到現地污物(糞便、泔水、血漿等)的影響。在絕對壓力為300 kPa(3 Bar)的情況下，應將泔水保持在121 ℃至少10 min[35]。pH為8的條件下，將豬糞水按照100 L·h-1的速度通過53 ℃的泥漿，可有效滅活ASFV。在密閉容器中最低溫度為70 ℃時維持30 min以上可滅活肉中的ASFV[38]。對于豬肉為原料的血液制品的消毒，采用的噴霧干燥設備溫度應不低于220 ℃，干燥后的物料要在60 ℃以上維持20 min以上才能確保ASFV完全滅活[38]。

2.2.2紫外線消毒紫外線(ultraviolet, UV)是實驗室和現地室內場所常采用的消毒方式。Risa等[39]發現，不同波長的UV照射能使受感染細胞內甲型流感病毒(IAVs)的核酸總量減少，并抑制細胞內mRNA(信使RNA)、vRNA(病毒RNA)和cRNA(互補RNA)的積累。UV滅活的ASFV刺激外周血單核細胞時能使T細胞系CD4+亞群和CD8+亞群同時增加[40]。900 J·m-2的UV照射劑量能使纖維蛋白原和凝血酶中的脂包膜病毒滴度下降至少4 log，且紫外照射前后纖維蛋白原和凝血酶的蛋白含量和結構沒有發生明顯變化[41]。近期有研究發現，254～257 nm的UV能使ASFV的核酸拷貝數隨照射時間的增長而減少[42]。此外，由于經水傳播的腸道病毒對紫外線具有一定的抵抗力[43]，因此，針對病毒的滅活需要提供至少186 J·m-2的有效消毒劑量[44]。當空氣濕度大于60%，應適當延長照射時間。

2.2.3γ射線消毒1983年，研究者采用20 kGy的γ射線滅活了ASF急性發病豬組織樣品中的ASFV,病毒的感染效價為104.6～107.8之間[45]。25 kGy鈷60-γ射線可有效滅活動物源性膜材中的病毒[46]。趙彥濤等[47]證實，γ射線輻照可使同種異體肌腱上的病毒滴度下降超過4 log，且不會影響肌腱的極限拉伸載荷和組織結構。

2.3 生物消毒法

生物消毒劑對囊膜病毒(如ASFV)可能具有良好的殺滅作用。但通常具有消毒作用的天然活性物質產量少，不能滿足大規模應用，因此，美國科學家研發出以人工合成維生素作為生物活性物質的消毒劑產品，已用于船舶壓艙水處理[48]。

2.4 環境生態修復法

研究人員對實施生態修復的試驗水體進行連續7個月的監控，結果顯示，水體的各項理化指標中總有機碳(TOC)、化學需氧量(COD)和總磷(TP)濃度均較使用修復劑之前大幅下降[48]。

2.5 其他新型病毒清除工藝

2.5.1低pH孵放法低pH孵放法對水皰性口炎病毒(VSV)和偽狂犬病毒(PRV)等脂包膜病毒滅活效果顯著。研究顯示，該法對VSV滅活效果≥4. 62 log TCID50·0. 1 mL-1，對PRV的滅活效果≥6.12 log TCID50·0.1 mL-1[49]。

2.5.2納濾膜技術傳統的水處理工藝中，跟超濾膜相比，納濾截留低分子量的能力更強，其可有效去除粒徑在納米級范圍的病毒[50]。2018年，Bao等[51]通過19 nm濾膜成功去除甘氨酸溶液中的豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)。

2.5.3陰離子交換層析陰離子交換色譜法(anion-exchange chromatography , AEX)是純化單克隆抗體藥物、蛋白質及血液等的常用方法[52-53]。Sivanathan等[54]采用陰離子交換色譜與二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素作為弱陰離子交換器清除了血液中的寄生蟲。該法也被用于某些包膜病毒的清除，例如，逆轉錄病毒(MuLV)和偽狂犬病病毒(PRV)[55]。

3 現階段消毒與檢測技術存在的問題

3.1 消毒效果不佳

消毒不徹底導致少量病毒殘留是豬場復養失敗、引發重大疫情和加大疫情傳播風險的重要原因。現地消毒劑使用不規范，部分豬場為圖便宜選擇不符合規定的劣質消毒藥[56]；不明確消毒劑的適用范圍，盲目選擇消毒藥；為省事不按照規范嚴格控制消毒周期、消毒劑量和消毒時間；對于消毒藥的藥性不熟知[57]，保存不當導致藥效減弱或喪失；消毒設施不完善[58]；消毒意識淡薄，沒有建立健全的消毒制度[59]等主觀原因是導致消毒不徹底的重要因素。

化學消毒劑的消毒效果受pH、被消毒物質質地、消毒劑濃度和作用時間以及病原微生物對外界環境抵抗力等因素的影響。近期研究發現，1% Virkon S 作用10 min能完全殺滅無孔表面和病毒懸液中的ASFV，不能完全殺滅經5% CO2(pH<8.5)處理過的多孔混凝土中的ASFV[60]。2 000 ppm次氯酸鈉能滅活無孔表面的ASFV和FMDV，但無法滅活木制材料上的FMDV[61]。據報道，4%的碳酸鈉溶液能使FMDV降低4個log單位以上，但只能降低3 log單位的ASFV[62]。因此，pH小于8.5、多孔質地、病毒囊膜結構均會影響消毒劑的消毒效果。此外，由于南北地域差異，空氣濕度、環境溫度、氣候條件、氣壓等因素也會使ASFV的滅活效果存在差異。

3.2 當前檢測技術的局限性

由于ASF的臨床特征與經典豬瘟等類似，臨床上難以鑒別，需要經實驗室檢測以確診。實驗室檢測包括病原學和血清學檢測。病原學檢測是通過檢測ASFV的核酸、抗原或病毒進行診斷。聚合酶鏈式反應(PCR)和實時熒光定量PCR(qPCR)是國際貿易中OIE指定的ASFV檢測方法[63-64]。Tignon等[65]基于p72基因設計的PCR引物和探針能檢測到的陽性率比OIE推薦的PCR和qPCR高21%和26%。研究顯示，現地經3% NaOH和5%次氯酸鈉消毒后，對部分環境樣品進行熒光定量PCR檢測，結果為陽性。因此，PCR陽性僅表明樣品中存在靶核酸序列但并不能說明樣品含有感染性的病毒[66]。雙抗體夾心ELISA常與qPCR方法平行對現地樣品進行檢測，敏感性、特異性較高，但仍無法確定目標抗原是否具有活性[67]。Heuschele等[68]通過免疫熒光法(IFA)快捷地檢測ASFV，該方法對急性ASF的診斷具有很高的靈敏度，但是對亞急性和慢性ASF的檢測靈敏度較低，而且熒光素的非特異性反應會造成假陽性結果。新型檢測技術，如微滴數字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、等溫擴增技術、熒光微球免疫層析試紙法等大幅提高了檢測的靈敏度和效率[69]，它們有望替代傳統的檢測方法,但同樣無法鑒別活病毒和滅活病毒。

針對活豬血液樣品，不需要確定其是否具有感染性，但針對曾經爆發過ASF的現地環境樣品，通過常規檢測手段就無法確定其中是否存在活病毒。基于ASFV的EP402R基因編碼的外囊膜蛋白CD2v能夠誘導紅細胞吸附現象[70]，研究者建立了血細胞吸附試驗(hemadsorption, HAD)用以鑒別ASFV的感染性，但實驗所需的豬肺泡巨噬細胞等價格昂貴，且ASFV細胞感染試驗需要在Ⅲ級生物安全實驗室(BSL-3)內進行，對于強陽性樣品通常在接種細胞的最初24 h內可觀察到紅細胞吸附現象,而對于不具有紅細胞吸附特性的ASFV則無法用該方法進行檢測。建議將HAD作為參考試驗用于確認ELISA、PCR或FAT的陽性結果。因此，目前還沒有檢測技術能夠完全、準確、快速地區分具有感染性的ASFV。

4 活病毒與滅活病毒鑒別檢測技術探討

非洲豬瘟感染性病毒的鑒別及消毒效果的評價是該病防控亟需攻克的重要難題，徹底清除病毒殘留是豬場復養的先決條件[71]，除了合理使用消毒劑外，感染性測定是必不可少的。針對現地樣品(除生豬血液樣品外)，檢測技術是檢驗消毒效果的必要手段，然而目前的感染性測定方法，如細胞感染試驗和紅細胞吸附試驗等，均具有一定的局限性，因此，鑒別檢測技術的建立對ASF的有效防控至關重要。

目前，已確定物理消毒對核酸分子結構具有破壞作用，化學消毒劑則主要破壞病原微生物的包膜結構，因此，根據不同消毒方式可采用相應的檢測技術。針對ASFV活病毒和滅活病毒的鑒別，應該在確定ASFV各種滅活方法的機理基礎上通過分析ASFV基因組結構和序列特點，挖掘ASFV的代謝脆弱區進行核酸檢測，以及從檢測包膜完整性的角度入手，建立一種快速、敏感、適用范圍廣且經濟實用的檢測技術。還可以借助目前的新技術檢測方法如等溫擴增技術、微滴數字PCR、熒光微球免疫層析等，提高檢測的簡便性和敏感性。這項技術的研發將對ASF的現地防控提供新技術支持，減少疫病傳播風險，降低經濟損失，同時，也能夠為未來可能的ASF弱毒疫苗的質控提供檢測手段。

武漢病毒研究所最近采用光敏熒光染料疊氮溴化丙錠(PMA)結合qPCR用于檢測樣品中是否具有感染性的ASFV粒子[72]。其原理是利用PMA不能穿透病毒包膜結構，但能非特異性修飾核酸分子，使其不能通過PCR或qPCR擴增，可用于鑒別包膜結構完整的ASFV。但其精確性和靈敏度還有待進一步檢驗。現地檢測中建議針對紫外和生物消毒法等主要通過破壞核酸使病毒失活的消毒方式滅活的樣品，可以相應采用核酸檢測技術(表1)，如PCR、定量PCR、多重PCR、套式PCR方法等；針對絡合碘、酚類、雙胍類等主要通過破壞病毒包膜結構的消毒劑滅活后的樣品，則應采用抗原檢測方法，如ELISA配合免疫熒光法；若是針對熱滅活、醛類、鹵素類、季銨化合物類消毒劑或新型病毒清除工藝滅活的樣品，以上檢測技術均可使用。非洲豬瘟對我國養豬業造成巨大打擊，我國豬肉供應離不開散養戶，散養戶在養殖過程中選用合理的消毒劑，規避消毒劑的缺陷，采用相對應的檢測技術是我國疫病防控的重要手段。

5 展望

ASF嚴重危害養豬業，消毒和檢測是防控該病的重要手段。目前的研究顯示，福爾馬林、戊二醛、次氯酸鹽、過氧化物、臭氧水和苯酚均是ASFV的高效消毒劑。高溫、紫外和射線照射、生態修復劑、低pH敷放法和納濾等廣譜消毒方式對ASF也有殺滅作用。化學消毒法主要通過破壞ASFV的蛋白質包膜結構使其失活，物理消毒法主要通過破壞其核酸結構使其失活。針對化學消毒劑滅活的環境樣品，建議選擇抗原檢測方法，針對物理消毒法消毒的樣品建議采用核酸檢測手段。

了解不同消毒方式的優缺點和適用范圍，規避消毒劑的缺陷，針對不同場所采用合適的消毒劑，針對不同質地和不同病原微生物適當調整滅活時間和消毒劑濃度。按規定合理使用消毒劑，并不斷完善檢測技術，根據消毒劑的滅活特點合理選擇檢測技術進行消毒效果評價對疫病的有效防控至關重要。同時，活病毒與滅活病毒的快速鑒別也是亟待解決的重大難題。