甘草苷調(diào)控PI3K/Akt/m-TOR信號通路對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞及裸鼠移植瘤小鼠的作用研究

鄧溪川 劉璐 王占利 姚睿

甘草苷(Liquiritin, LIQ)是甘草類黃酮的主要成分，具有顯著的抗癌作用，研究表明，LIQ通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖來發(fā)揮其抗癌效果，然而，LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌的效果和相關(guān)分子機(jī)制還沒有被揭示，本研究探討了LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞活力、凋亡的影響并通過構(gòu)建裸鼠瘤模型進(jìn)行了體內(nèi)驗證，并分析了的PI3K/AKT/m-TOR信號通路在其中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和動物分組

人口腔鱗狀細(xì)胞癌Cal-27、Tca8113細(xì)胞系、人正常肝QSG-7701、人正常腎293T細(xì)胞系購自于中國科學(xué)院細(xì)胞研究所； 24 只6～7 周齡SPF級BALB/c nu/nu雄性裸鼠，體重18～20 g， 購自上海杰思捷實(shí)驗動物有限公司，實(shí)驗分為四組(對照組、低濃度LIQ處理組，中濃度LIQ處理組和高濃度LIQ處理組)；各組小鼠在恒溫恒濕的IVC小鼠房進(jìn)行飼養(yǎng)，所有接觸的籠具，飲水，飼料等均進(jìn)行滅菌處理，并已通過實(shí)驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

LIQ(CAS:551-15-5, HPLC≥98%)(上海純優(yōu)生物科技有限公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基、PRMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone公司， 美國)；胰蛋白酶-EDTA細(xì)胞消化液(TE)、FBS 胎牛血清和鏈霉素-青霉素(PS)雙抗(上海冰晴公司)；一抗、二抗(北京索萊寶生物科技公司)；CCK-8試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL檢測試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)。

ReadMax 1900Plus型光吸收全波長酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司)；海爾HCB-900V潔凈工作臺(上海臣蓮生物科技發(fā)展有限公司)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(SANYO公司，日本)；流式細(xì)胞儀(貝克曼-庫爾特生有限公司， 美國)。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 CCK-8實(shí)驗檢測LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌的殺傷作用 體外實(shí)驗利用CCK-8實(shí)驗檢測LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的殺傷作用和對正常細(xì)胞的毒副作用，將Cal-27、Tca8113、QSG-7701和293T細(xì)胞以1×105的濃度接種至96 孔板中。當(dāng)細(xì)胞滿度長到60%時饑餓處理2 h，隨后用不同終濃度(0、 5、 10、 20、 30及40 μmol/L)的LIQ處理，每個濃度梯度設(shè)置8 個復(fù)孔。藥物處理24 h后將10 μL CCK-8溶液加入孔中并放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，利用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測量吸光度值，實(shí)驗重復(fù)3 次并計算細(xì)胞存活率及IC50值(半數(shù)致死濃度)。用細(xì)胞存活率衡量LIQ對細(xì)胞的殺傷作用。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌的誘導(dǎo)凋亡作用 將Cal27細(xì)胞以1×105個每孔接種至6 孔板，用IC50值濃度的LIQ分別處理Cal27細(xì)胞3、 6、 12和24 h，收集細(xì)胞并經(jīng)過PBS清洗后，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，加入195 μL的 Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入3 μL Annexin V-FITC與2 μL PI，室溫避光孵育15 min，每組加入300 μL PBS，轉(zhuǎn)移至流式管后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗重復(fù)3 次，驗證Cal27細(xì)胞的凋亡情況。

1.3.3 口腔鱗狀細(xì)胞癌小鼠的構(gòu)建與分組 體內(nèi)實(shí)驗首先需要構(gòu)建裸鼠移植瘤模型并將裸鼠分組。因裸鼠不具備胸腺，沒有免疫能力，將Cal27細(xì)胞以3×107個/mL的細(xì)胞密度重懸，然后以每只200 μL細(xì)胞懸液為基準(zhǔn)，在SPF級環(huán)境下將細(xì)胞皮下接種至裸鼠背部右側(cè)靠近腋窩處，每天觀察裸鼠及腫瘤狀況，當(dāng)接種裸鼠均出現(xiàn)直徑大5 mm3的圓形或橢圓形皮下質(zhì)硬結(jié)節(jié)，即為模型建立成功。根據(jù)本研究設(shè)定的實(shí)驗方案，將裸鼠隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4 組，具體為空白對照組、LIQ低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40 mg/kg) 3 個濃度實(shí)驗組，給藥通過灌胃的方式，每2 d/次進(jìn)行，給藥10 次，實(shí)驗中各組裸鼠未出現(xiàn)死亡情況。停藥后，犧牲裸鼠，剝離腫瘤備用。

1.3.4 對裸鼠瘤小鼠腫瘤體積及重量的測定 實(shí)驗過程中，每2 d用游標(biāo)卡尺對瘤體的體積進(jìn)行測量，計算公式為V=1/2×長徑×短徑2；待實(shí)驗結(jié)束處死小鼠后，完整剝離腫瘤，記錄瘤體最終的質(zhì)量；計算口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤抑制率=(空白對照組瘤重均值-實(shí)驗組瘤重均值)/空白組對照瘤重均值×100%。

1.3.5 TUNEL法檢測LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 將取出的腫瘤組織進(jìn)行固定、石蠟包埋，并按4 μm厚切片，然后按TUNEL檢測試劑盒說明書操作，對腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測。每張切片隨機(jī)選取5 個視野(×200)，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，并計算細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)。

1.3.6 Western Blotting檢測腫瘤組織細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白變化 取出在低溫條件下保存的移植瘤組織，用超聲波破碎儀超聲 10 s，在4 ℃離心機(jī)中以14 000×g離心30 min，取上清蛋白，BCA法測蛋白含量，配置10%～15%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，隨后轉(zhuǎn)移至NC膜上，麗春紅染色后，TBST洗膜，脫脂乳封閉，一抗4 ℃水平搖床孵育過夜。第2 天取出后，TBST洗膜，二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，再通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。內(nèi)參選擇α-tubulin，并利用ImageJ軟件對所出條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的殺傷作用

從表 1中可以看出，LIQ能夠明顯抑制兩種口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，并且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和時間依賴性，經(jīng)計算LIQ對Cal27、Tca8113的IC50值分別為(19.2±0.8)、 (23.4±0.5) μmol/L。在對正常細(xì)胞的檢測中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LIQ濃度為40 μmol/L時， 2 種正常細(xì)胞的存活率均處在90%以上，說明LIQ對2 種正常細(xì)胞的毒副作用較小。

表 1 LIQ在體外抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖

2.2 LIQ對Cal27細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

從圖 1A中可以看出，隨著LIQ處理時間(0、 3、 6、 12、 24 h)的不斷增加，早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，凋亡細(xì)胞數(shù)目百分比分別為2.88%±0.52%、5.09%±1.37%、 24.19%±2.28%、 35.25%±2.94%、 50.42%±2.87%； 隨后對凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)LIQ能夠以時間依賴性的方式上調(diào)Bax， Caspase-3和Cytochrome C(Cyto-C)的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)(圖 1B)，說明LIQ能夠通過線粒體依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)Cal27細(xì)胞凋亡。

圖 1 LIQ誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌Cal27細(xì)胞凋亡(*: 與0 h相比， P<0.01)

2.3 LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌裸鼠移植瘤的影響

體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果顯示與對照組相比，LIQ能夠明顯抑制裸鼠移植瘤生長，瘤體的體積和瘤重明顯減少，腫瘤抑制率為15.92%、 48.67%和68.14%(P<0.05)，呈現(xiàn)出濃度依賴性(圖 2)，在對小鼠體重的檢測中，我們發(fā)現(xiàn)，LIQ灌胃給藥沒有影響到小鼠的體重，說明LIQ對小鼠沒有明顯的毒副作用，表明LIQ能夠在一定范圍內(nèi)以濃度梯度來抑制腫瘤的生長。

2.4 LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的影響

從TUNEL實(shí)驗檢測結(jié)果中可以看出，隨著LIQ處理劑量的不斷增加，視線范圍內(nèi)黃棕色的細(xì)胞數(shù)目不斷增加 (黃棕色表示發(fā)生凋亡的細(xì)胞， 藍(lán)色表示未凋亡細(xì)胞)，并具有明顯的濃度依賴性(圖 3)，進(jìn)一步證明了LIQ具有誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的作用。

圖 2 LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌裸鼠移植瘤的抑制作用(*: 與對照組相比， P<0.01)

表 2 LIQ對裸鼠瘤重量的影響及腫瘤抑制率

2.5 LIQ調(diào)節(jié)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞胞中PI3K/AKT/m-TOR信號通路

為了檢測在LIQ誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡過程中，有哪些信號通路參與了這個過程，檢測了PI3K/AKT/m-TOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化情況。如圖 4所示，隨著LIQ處理時間的不斷延長，PI3K，p-AKT， m-TOR的表達(dá)量逐漸降低， 具有明顯的時間依賴性，與對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)。

圖 3 LIQ誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡(×200)

圖 4 LIQ對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中PI3K/AKT/m-TOR信號通路的影響(*: 與0 h相比， P<0.01)

3 討 論

目前為止，口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理還未被完全揭示，對于這種對人類危害極大且發(fā)病率死亡率逐年上升的癌癥，其治療方法已經(jīng)成為減輕病患的關(guān)鍵[1]。國內(nèi)外眾多研究都證明植物中的許多活性成分能夠有效抑制癌細(xì)胞的增殖和瘤體的增長，中藥提取物作為潛在的化學(xué)治療藥物開發(fā)前景廣闊[2]。LIQ是從豆科甘草屬植物甘草中提取出來的黃酮類單體活性成分，具有多種生物活性，具有來源廣泛、價格低廉、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，近年來有研究表明，LIQ對宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌等癌癥具有良好的抑制作用，其抗腫瘤作用受到越來越多的關(guān)注[3-4]。本研究通過用不同濃度的LIQ作用口腔鱗狀細(xì)胞癌Cal27、Tca8113細(xì)胞后，結(jié)果表明LIQ能夠呈劑量和時間依賴性地抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞活力，在對正常細(xì)胞的殺傷作用檢測中發(fā)現(xiàn)，LIQ對正常的肝腎細(xì)胞沒有明顯的毒副作用，提示LIQ具有高效抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長且低毒的作用。

隨著對口腔鱗狀細(xì)胞癌研究的進(jìn)一步深入，越來越多的研究學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡在口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和愈后化療的過程中都扮演著重要角色，手術(shù)切除后再輔以化療藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是當(dāng)前癌癥治療中最可行的方法之一[5]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞增殖的屏障，可以阻止腫瘤細(xì)胞的過度增殖，為了驗證LIQ是否是通過誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制其增殖的，進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實(shí)驗從細(xì)胞和分子兩個層面分別對細(xì)胞凋亡進(jìn)行了檢測。從結(jié)果中可以看出，LIQ能夠以時間依賴性的方式上調(diào)Bax，Cyto-c，Caspase3的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。

PI3K/AKT/m-TOR信號通路是一條經(jīng)典的細(xì)胞通路，PI3K在整個信號通路的上游，AKT是整條通路的核心，m-TOR是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，處于整條信號通路下游，該信號通路調(diào)控著細(xì)胞的增殖、凋亡、各種物質(zhì)的合成和代謝等過程，同時還調(diào)控著眾多信號分子，如Caspase家族、Bcl-2家族的各種蛋白[6]。近年來的研究表明，PI3K/AKT/m-TOR信號通路在卵巢癌，肝癌等多種癌細(xì)胞中處于過表達(dá)的狀態(tài)，抑制該信號通路的表達(dá)能夠起到抗癌的作用[7]。同樣，PI3K/AKT/m-TOR信號通路參與口腔鱗狀細(xì)胞癌的形成、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、影響血管新生等方面具有明顯的調(diào)控作用，且在口腔鱗狀細(xì)胞癌中一直處于一個過表達(dá)的狀態(tài)[8-9]。本實(shí)驗的研究表明，LIQ能夠下調(diào)PI3K，p-AKT，m-TOR的蛋白表達(dá)，抑制PI3K/AKT/m-TOR信號通路，從而起到誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌凋亡并抑制增殖的作用。同時，體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果表明，LIQ能夠有效地抑制裸鼠瘤小鼠瘤體的體積，降低瘤體的重量，與對照組相比有顯著性差異并具有明顯的濃度依賴性，并且TUNEL實(shí)驗結(jié)果表明，LIQ處理組的裸鼠瘤體細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的數(shù)量逐漸升高，也進(jìn)一步驗證了LIQ能夠誘導(dǎo)體內(nèi)的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜合以上實(shí)驗結(jié)果，可以推斷LIQ能夠在體內(nèi)外對口腔鱗狀細(xì)胞癌產(chǎn)生抗癌效果，其作用機(jī)制可能是通過抑制PI3K/AKT/m-TOR信號通路，使Bcl-2/Bax蛋白之間形成同二聚體，降低了線粒體膜電位，使其通透性降低，導(dǎo)致Cyto-C從線粒體中釋放，激活Caspase-3，觸發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌凋亡。本實(shí)驗為LIQ在治療口腔鱗狀細(xì)胞中的應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)，但是仍然有一些具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。