姜黃素通過調(diào)控Wnt通路改善牙周膜干細胞成骨分化能力

呂威 王鶴丹 苑春麗

牙周組織的修復與再生的相關研究一直都是口腔領域的研究熱點[1-2]。人牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是一類具有干性和成骨分化的潛能的多功能干細胞，是牙周骨缺損修復的重要細胞群，同時其易于分離與培養(yǎng)，是牙周骨再生最可靠的細胞來源[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)牙周炎會激活經(jīng)典的Wnt信號通路，進而下調(diào)成骨相關的關鍵基因表達(包括ALP、OCN以及Runx2等)，抑制PDLCs的成骨分化能力。

姜黃素是一種從姜科、天南星科植物的根莖中提取的一種二酮類化合物，易溶于有機溶劑，具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著下調(diào)Wnt通路相關蛋白質(zhì)β-catenin的表達，進而抑制乳腺癌的進展。近年來，越來越多的研究表明，姜黃素的抗腫瘤作用是通過抑制Wnt相關信號通路而實現(xiàn)的[6-8]，包括宮頸癌和肺癌等，但是關于姜黃素能否也通過調(diào)控Wnt通路來改善人牙周膜干細胞的成骨分化能力尚不明確。本研究探索了姜黃素對人牙周膜干細胞增殖能力及成骨分化能力的影響，并進一步闡明其具體的作用機制，以期望為牙周骨缺損修復的治療開辟新道路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(Amresco公司，美國)；L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素(Gibco公司，美國)；α-MEM培養(yǎng)液；qPCR RT Master Mix、SYBR?Premix EX TaqTMⅡ(Takara公司，日本)；堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成); 紫外線分光光度儀(Ep- pendorf，德國); CO2孵箱(Heraeus，德國)。

1.2 PDLSCs 分離和培養(yǎng)

收集因正畸減數(shù)或阻生新鮮拔除的健康第三磨牙或第一前磨牙， 牙齒拔出后立即用PBS溶液沖洗3 遍，再用無菌的銳利刀片刮取根中1/3區(qū)域的牙周膜組織，并剪成1 mm3大小的組織塊。離心后，加入I型膠原酶2 mL， 并置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化。15 min后，用培養(yǎng)基終止消化并離心，將組織塊以1 mm間距平整放于6孔板中，上置蓋玻片，滴加含 100 mL/L FBS 的α-MEM培養(yǎng)液， 37 ℃、 50% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每隔3 d換液，待細胞從組織塊邊緣爬出并生長匯合達80% 時，用0.25%的胰酶進行消化，按1 ∶2或1 ∶3的比例傳代，實驗選用4～6 代的細胞。

1.3 CCK-8實驗評估PDLSCs的增殖能力

將處于對數(shù)生長期的PDLSCs細胞接種于96孔板上，將細胞分為實驗組和對照組。 24 h后，對照組細胞加入100 μL不含姜黃素的培養(yǎng)基，而實驗組細胞則加入含40 μmol/L姜黃素的細胞培養(yǎng)基。分別于培養(yǎng)1、 2、 3、 4、 5、 6 d各時間點取出各組細胞，去除原有的培養(yǎng)基，再加入含10 μL CCK-8溶液的細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育2 h。最后，用酶標儀(Bio-Tek, Winooski, VT，美國) 測定每個測量孔在450 nm處吸光度，并記錄結果進行對比分析。

1.4 ALP 活性的測定

取經(jīng)含或不含姜黃素的細胞培養(yǎng)及對PDLSCs細胞進行1 周處理后，吸去培養(yǎng)液，PBS 沖洗后，按堿性磷酸酶測定試劑盒說明進行操作，最后用酶聯(lián)儀檢測各孔520 nm波長處的吸光度值(A值)。

1.5 實時熒光定量RT-qPCR實驗

根據(jù)說明書，通過Trizol試劑進行細胞內(nèi)總RNA的提取，將500 ng的RNA逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板按照SYBR Green I法進行目的基因的熒光定量PCR反應。qPCR 反應條件: 預變性，95 ℃、30 s，1 Cycle; PCR 反應， 95 ℃、 5 s， 60 ℃、 20 s， 40 Cycles; 融解曲線分析， 95 ℃、 0 s， 65 ℃、15 s， 95 ℃、0 s。此外，本研究的引物序列如表 1所示。

1.6 茜素紅染色

收集成骨誘導培養(yǎng)21 d的各組PDLSCs，多聚甲醛(4%)固定10 min， 茜素紅染色。將處理后的6 孔板置于倒置顯微鏡下觀察其礦化結節(jié)拍照，Image-Pro Plus 圖像處理軟件進行礦化結節(jié)定量分析。

表 1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 姜黃素對PDLCs增殖能力的影響

CCK-8實驗結果顯示實驗組的hPDLCs在加入40 μmol/L的姜黃素共培養(yǎng)后，所有時間點的細胞增殖能力均較對照組細胞有所升高，但差異沒有統(tǒng)計學意義(圖 1)。

2.2 姜黃素對PDLSCs成骨分化能力的影響

藥物誘導1 周后， 分別收集實驗組和對照組的細胞進行實時定量RT-qPCR實驗，結果顯示加入姜黃素后，實驗組中的成骨相關基因ALP、OCN以及Runx2的mRNA表達水平均明顯升高(圖 2)。此外，實驗組的細胞內(nèi)ALP活性明顯高于對照組(圖 3)。也就是說，姜黃素對PDLSCs成骨分化能力有促進作用。

圖 1 姜黃素對PDLCs增殖能力的影響

圖 2 姜黃素對PDLSCs成骨相關基因表達的影響

圖 3 姜黃素對PDLSCs的ALP活性的影響

2.3 姜黃素對Wnt信號相關信號通路的影響

RT-qPCR技術檢測姜黃素對PDLSCs細胞內(nèi)經(jīng)典Wnt通路相關基因的表達水平進行檢測。結果顯示，姜黃素能顯著下調(diào)Wnt通路相關基因c-myc和β-catenin(圖 4)。此外，在經(jīng)姜黃素處理后的PDLSCs細胞株中加入氯化鋰后，PDLSCs成骨分化能力會有所下調(diào)(圖 4)。這一致說明了姜黃素引起的PDLSCs成骨分化能力增強是通過抑制細胞內(nèi)的Wnt通路起作用的。

2.4 姜黃素對PDLSCs鈣化結節(jié)形成的影響

茜素紅礦化結節(jié)染色實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，經(jīng)姜黃素處理可以明顯提高PDLSCs鈣化結節(jié)的形成量。當在實驗組中加入Wnt通路激動劑(氯化鋰)，PDLSCs鈣化結節(jié)的形成量明顯減少(圖 5)。說明姜黃素可以通過調(diào)控Wnt通路發(fā)揮促PDLSCs成骨分化的作用。

圖 4 姜黃素對Wnt信號通路相關基因表達的影響

圖 5 姜黃素對PDLSCs礦化結節(jié)形成量的影響

3 討 論

牙周炎是由細菌引起的牙周組織慢性進行性炎癥反應，其最嚴重的并發(fā)癥是導致患者的牙齒喪失，而人牙周膜干細胞(PDLSCs)是修復牙周缺損的關鍵細胞[9]。牙周膜干細胞是從牙周組織中分離培養(yǎng)而形成的成體干細胞，具有多向分化潛能[10-11]。但是，對于牙周炎患者而言，牙周膜干細胞的成骨分化能力會被顯著抑制。因此，探索能改善牙周炎患者牙周膜干細胞成骨分化能力的藥物并闡明其作用機制是近年來牙周組織修復與再生研究的熱點。

姜黃素是一種天然多酚，主要來源于中藥姜黃、莪術等植物，具有毒性小、價格便宜、易提取等優(yōu)勢。姜黃素藥理學作用廣泛，具有抗炎、抗纖維化及促成骨分化等多種生物學效應。大量研究表明，姜黃素可以抑制破骨細胞的活性，促進骨的重建，緩解各種不同原因所致的骨質(zhì)疏松[12-13]。同樣地，在本研究中，我們通過RT-qPCR技術也發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素處理后，可以明顯上調(diào)PDLSCs的成骨分化相關基因(ALP、OCN以及Runx2)的表達水平，提高ALP的活性以及鈣化結節(jié)的形成量。但是，結果顯示姜黃素并不影響PDLSCs的增殖能力。總的來說，姜黃素能顯著改善PDLSCs細胞的成骨分化能力，但具體的作用機制尚不明確。

既往研究發(fā)現(xiàn)，多個細胞因子、生長因子信號通路的調(diào)控，包括BMP、Wnt、Notch、FGF、PI3K/Akt 等信號通路會影響成骨分化關鍵基因的表達與功能，在調(diào)控牙周膜干細胞成骨分化過程起到重要的作用[14-15]。在牙周膜干細胞成骨分化過程中的研究較多為 Wnt 經(jīng)典信號通路，它在調(diào)控細胞的增殖、成骨分化中起著重要作用。廖海清等[16]發(fā)現(xiàn)阻斷經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路將會顯著減低ALP的活性，并顯著減少礦化結節(jié)的形成量，進而抑制牙周膜干細胞的成骨分化能力。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能通過調(diào)控Wnt相關信號通路抑制多種腫瘤進展，包括乳腺癌、肝癌等。因此，本研究提出假設：姜黃素有可能是通過阻斷Wnt信號通路來發(fā)揮促牙周膜干細胞成骨分化作用。本研究中，發(fā)現(xiàn)姜黃素的確能抑制Wnt信號通路關鍵基因c-myc和β-catenin的表達；同時，對經(jīng)姜黃素處理后的PDLSCs中加入Wnt通路激動劑，PDLSCs的成骨分化能力會被明顯抑制。

本研究表明姜黃素能通過抑制Wnt相關信號通路的激活，促進 PDLSCs 向成骨細胞分化，這為其應用于修復牙周骨缺損提供了科學依據(jù)。