ISO對大鼠正畸牙移動效果及牙周組織中Runx2、 ODF水平的影響

楊爍 燕玉敏

1. 274300菏澤, 單縣中心醫院口腔內科； 2. 濱州市中醫院口腔科

隨著人們生活水平的提高，對正畸的需求也不斷擴大。正畸治療是通過移動牙齒矯正錯畸形，這一過程包括受正畸力的牙槽骨和牙周膜組織改建[1]。牙移動伴隨根吸收作為正畸常見的并發癥，其發生概率可達3%～100%[2]。因此，提高矯正效率的同時保持矯正后的穩定性顯得尤為重要。異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)是β腎上腺素受體激動劑，有研究表明，交感神經系統可調節破骨細胞和成骨細胞的活動，在骨的生理和病理變化中起到重要作用[3]。本研究通過大鼠正畸牙移動模型的建立，探討ISO對大鼠正畸牙移動效果及Runt相關轉錄因子(Runt-related transcription factor 2， Runx2)、 破骨細胞分化因子(Osteoclast differentiation factor， ODF)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽酸異丙腎上腺素、戊巴比妥鈉(西格瑪奧德里奇中國有限公司)；EDTA脫鈣液(上海舜百生物)；抗酒石酸酸性磷酸酯酶試劑盒、辣根過氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；鎳鈦拉簧(杭州新齒科材料有限公司)；正畸測力計(杭州奧索醫療器械有限公司); 游標卡尺(廣州儀表儀器有限公司)；顯微鏡(Olympus，日本)；Runx2、ODF抗體(Abcam公司)。

1.2 實驗動物

8 周齡SPF級SD雌性大鼠40只(購自華東師范大學，使用許可證號SYXK(滬)2015-0025)，體重約(200±20) g，自由飲食、飲水，溫度(25±1) ℃，濕度(60±10)%。

1.3 動物模型的建立和治療方法

1%戊巴比妥鈉腹腔注射大鼠，待麻醉后于大鼠右上頜第一磨牙和切牙用快速渦輪機將固位溝磨出(深約1 mm)，在右上第一、二磨牙之間穿過正畸不銹鋼結扎絲(約0.02 mm)，將鎳鈦拉簧一端固定，正畸測力計測出50 g彈簧力值的距離，將拉簧的另一端用不銹鋼絲結扎固定于切牙的固位溝。每日檢查并維持加力裝置。按隨機數字表法分成對照組和ISO組，各20 只。ISO組腹腔注射5 mg/(kg·d)的ISO，對照組給予等體積的生理鹽水， 1 次/d， 連續給藥21 d。

1.4 測量牙齒移動距離

分別于0、 7、 14、 21 d通過大鼠腹腔注射過量1%戊巴比妥鈉(10 mg/100 g)處死大鼠(每組5 只)，剪下大鼠上頜頜骨，去除周圍軟組織，采用游標卡尺測定測量大鼠左上頜第一、二磨牙近中頰溝點間的距離，兩數值差值為大鼠右上第一磨牙近中移動距離。

1.5 標本制作

分批處死2 組大鼠后，將右上頜第一磨牙及周圍頜骨完整取出，置于4%多聚甲醛固定， 24 h后取出，于4 ℃的EDTA脫鈣液中脫鈣6 周，取出后梯度乙醇脫水，包埋，沿牙體長軸切片，厚度為3 μm。HE染色后，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 破骨細胞數量計數

選擇2 組不同時間點的切片各5 張，根據抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒進行TRAP染色，顯微鏡下觀察并計數Howship陷窩內細胞核數量≥3、陽性的多核破骨細胞，取平均值。

1.7 免疫組化法檢測Runx2和ODF水平

切片脫蠟，微波修復后置于pH=6的枸櫞酸鹽緩沖液中，取出后加入一抗， 4 ℃過夜，沖洗后加入二抗， 37 ℃ 30 min，沖洗后辣根過氧化物酶顯色，蘇木素復染，脫水后中性樹膠封片，觀察各組Runx2和ODF水平變化。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 2 組大鼠牙齒的移動距離

與加力前相比， 2 組大鼠的牙齒均明顯移動，且ISO組大鼠不同時間的牙齒移動距離顯著長于對照組(P<0.05)(表 1)。

表 1 2 組大鼠牙齒的移動距離比較

2.2 HE染色結果

ISO組在0 d (即對照組) 時牙周膜形態較好， 牙槽骨未見明顯骨吸收，牙根兩側可見相同寬度的牙周膜；ISO組7、 14、 21 d壓力側可見破骨細胞，牙周膜變窄，牙槽骨表面存在骨吸收陷窩，張力側可見牙周膜變寬(圖 1)。

A： 0 d(對照組)； B～D： ISO組正畸開始第7、 14、 21 天

2.3 破骨細胞計數結果

2 組大鼠破骨細胞在0 d時數目較少， 7、 14 d和21 d 時2 組大鼠右上頜第一磨牙壓力側顯示較多的破骨細胞，其中ISO組破骨細胞數目較對照組多，差異有統計學意義(P<0.05)(表 2)。

2.4 Runx2 和ODF表達水平

2 組大鼠牙周膜中Runx2表達水平明顯升高，其中ISO組明顯高于對照組(P<0.05)； 2 組大鼠牙周膜中ODF表達水平明顯升高，其中ISO組明顯低于對照組(P<0.05)(表 3)。

表 2 2 組大鼠破骨細胞數目

3 討 論

表 3 2 組大鼠Runx2 和ODF表達水平

表 3 2 組大鼠Runx2 和ODF表達水平

分 組0 d7 d14 d21 dRunx2ODFRunx2ODFRunx2ODFRunx2ODF對照組21.01±0.4713.70±1.0122.82±0.2117.28±0.4523.89±0.2320.38±0.3125.01±0.3122.18±0.40ISO組21.01±0.4713.70±1.0123.39±0.2415.03±0.3025.73±0.2817.19±0.2227.79±0.4019.37±0.33t值0.0000.0003.0159.30311.35518.76512.28412.117P值1.0001.0000.0170.0000.0000.0000.0000.000

Runx2 是一種特異性的成骨標志物，在轉錄水平參與了骨組織的多種特異性蛋白調控，并在成骨細胞的生長、分化過程中起中要作用[7]。周璨等人的研究發現，在大鼠正畸過程中牙周組織的成骨細成牙骨質細胞以及成纖維細胞中存在Runx2的表達，并且參與了牙周組織的改建過程[8]。有研究顯示，在Runx2缺失的小鼠骨骼細胞中，可能通過對ODF表達水平的調節參與形成破骨細胞[9]。ODF是破骨細胞抑制因子/骨保護素的一種配體，牙周組織細胞中ODF的表達與破骨細胞的分化程度密切相關[10]。為探討ISO在大鼠正畸治療過程中的作用機制，本研究檢測了ISO作用后大鼠牙周組織中的Runx2和ODF的表達水平。結果顯示，加力后兩組大鼠牙周膜中Runx2表達水平明顯升高、ODF表達水平明顯升高，但 ISO組的Runx2表達水平高于對照組，ODF表達水平低于對照組，其可能原因是ISO通過促進牙周組織的Runx2、抑制ODF表達水平，抑制了正畸牙移動過程中破骨細胞的生成、活化和骨吸收這些關鍵步驟，影響了大鼠正畸牙的移動速度。

綜上所述，異丙腎上腺素可促進大鼠正畸牙移動，并影響Runx2和ODF的表達水平。但在長期的正畸治療過程中，ISO的安全性和有效性還有待進一步的研究。