溫度和重復測定對秦嶺細鱗鮭快速啟動反應、游泳性能及力竭后代謝特征的影響

彭敏銳,鄭雪麗,李 平,李秀明,夏繼剛,*

1 進化生理與行為學實驗室,重慶市動物生物學重點實驗室,重慶師范大學生命科學學院, 重慶 401331 2 陜西省水產研究所,西安 710086

溫度是水生生態系統中決定魚類等外溫動物生存與分布的關鍵因子[1- 5]。氣候變化模型預測本世紀末全球將升溫0.3—4.8℃[6]。溫度增加將造成很多魚類物種喪失其最佳的棲息地環境,生理功能受限進而導致其適合度下降[7- 11]。在全球氣候變暖的背景下,迫切需要對魚類(特別是冷水性魚類)的溫度適應性問題進行深入系統的探究。

溫度顯著影響魚類的代謝率[10- 12]。代謝率體現了能量吸收、轉化和分配的速率,是基本生物學速率[13],與動物的運動能力、生長性能、熱適應特性等密切相關[13-15]。正如遺傳理論被認為是進化生物學研究的基礎一樣,生態代謝理論(Metabolic theory of ecology)被認為是大部分生態學研究的基礎[13]。有關魚類應對溫度升高的生理響應,Sandblom等[11]形象地提出了“可塑的底層與凝固的天花板(Plasticoors and concrete ceilings)”假說,即溫度升高將導致魚類維持能量消耗(標準代謝率Standard metabolic rate, SMR)增加,而最大代謝率(Maximum metabolic rate, MMR)卻保持不變甚至下降,其結果是導致有氧代謝空間(Metabolic scope,MS)變小。MS是動物各種生理功能可能占用的潛在代謝空間,MS變小被認為主要是與高溫下心鰓系統供氧功能不足以滿足機體的氧需求有關(基于氧供需能力限制的熱忍耐假說Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance, OCLTT)[12,16],這種生理功能的限制最終將對魚類的游泳性能、生長發育、繁殖等產生抑制效應[9-12,15]。

由于水體環境的特殊性,游泳運動作為魚類集群、洄游、覓食及逃避捕食者等行為實現的主要方式,為魚類的生存與繁衍提供了基本保證,與其適合度密切相關[15,17]。魚類為實現不同生理活動所采用的游泳方式不同。快速啟動(Fast-start)是魚類逃避天敵得以生存的基本方式,體現了魚體運動系統和神經系統的整體性能[15]；快速啟動持續時間通常少于1 s,但與魚類的捕食或逃逸對策密切相關[18- 19]。步法轉換速度(Gait transition speed,Ugait)指隨著水流速度增加,魚體開始出現“爆發-滑行”姿態變化且在水流中相對位置上下移動這一行為時的游泳速度,該速度有時也被認為是魚類的最大有氧運動速度,之后魚體開始大量動用白肌提供能量完成高速游泳[20- 21]。勻加速游泳速度(Constant acceleration test speed,Ucat)通常指以恒定的加速度持續增加水流速度直至魚體出現力竭狀態時的游泳速度,勻加速游泳是一種快速的高能耗游泳運動,在魚類捕食—逃避敵害、尤其是穿越激流尋找適宜生境等生存活動中發揮重要作用[15,22-23]。然而,由于加速游泳主要依賴于無氧代謝供能,導致白肌中ATP、磷酸肌酸和糖原的大量消耗以及肌肉和肝臟中乳酸的累積[24-27],力竭運動后的代謝恢復能力將直接影響魚類后續的加速游泳性能[25,28]。魚類的游泳性能易受溫度變化的影響[5,23,27,28],對不同溫度下重復游泳性能及其力竭后代謝特征的評估是十分必要的,有助于洞察溫度影響下魚類生理功能與生態表現的穩定性與可持續性。

秦嶺細鱗鮭(Brachymystaxlenoktsinlingensis)隸屬于鮭形目、鮭科、細鱗鮭屬,是目前世界上分布最南端的兩種鮭科魚類之一,為國家Ⅱ級重點保護水生野生動物[5,29-31]。該物種是第四紀冰川時期自北方南移的殘留物種,為典型的陸封型冷水性山麓魚類,地域分布范圍狹窄、生境特殊、主要分布于秦嶺山系海拔900—2300 m的山澗溪流及深潭中[29- 30]。調查研究發現,該物種對生境水溫有嚴格要求,易受全球氣候變化和人為活動的影響,近20年來,其生存海拔下限已顯著提升了200—300 m[5,31-32]。然而,盡管水溫是決定該物種生存與分布的關鍵因子,迄今為止其熱生物學相關研究十分匱乏。游泳性能對秦嶺細鱗鮭生存繁衍至關重要,為其生殖洄游(需具備較強的有氧運動能力)、穿越激流等復雜生境(需要具備較強的加速游泳能力)以及快速追擊捕食(需具備較強的快速啟動能力)提供了基本保障,加之氣候變化和筑壩等人為活動導致生境水流變化又對其游泳性能提出了更高的要求[33]。本研究考察了溫度和重復測定對秦嶺細鱗鮭快速啟動反應、游泳性能及力竭后代謝特征的影響,以期為該物種的保護生理學研究與實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

秦嶺細鱗鮭幼魚((22.1±0.98)g,(11.4±0.14)cm,n=27)采自陜西太白湑水河珍稀水生生物國家級自然保護區(33°744′N, 107°460′E),將實驗魚于自凈化循環控溫系統(500 L)馴養21 d以使之適應實驗室環境。馴養條件如下：實驗用水為充分曝氣脫氯并經過活性炭過濾的自來水,水溫(13.5±0.5)℃(與采樣點的溫度接近),水體溶氧≥90%飽和溶氧,氨氮濃度<0.01 mg/L,水體底部放置若干大石塊以模擬自然生境；每日8:00飽足投喂黃粉蟲幼蟲(Tenebriomolitor)一次,投喂20 min后,吸去殘餌并更換1/5水體以保持水質清潔。

1.2 實驗方案

本研究共設置6℃、12℃和18℃ 3個生態相關的溫度梯度(其中,18℃代表了實驗魚棲息地夏季最熱月份的平均溫度,6—12℃為實驗魚的繁殖適宜溫度,當春季溫度高于6℃時實驗魚向上游產卵洄游而當冬季溫度低于6℃時向下游越冬洄游[5])。適應結束后,將實驗魚隨機平均分為3組,每組9尾(n=9),分別移養至3個相同的自凈化循環控溫水槽；然后,將各組水溫從(13.5±0.5)℃開始以1℃/d的速率升溫或降溫至設定的3個馴化溫度(6、12、18℃),并將實驗魚在各自相應的溫度下馴化21 d。溫度馴化期間,除了水溫不同外,其余水質環境條件以及喂養水平等與馴養適應期間保持一致。

馴化結束后,將實驗魚禁食24 h,連續兩次測定其快速啟動表現,兩次測試的時間間隔為15 min。之后,將實驗魚放回原有馴養水體恢復適應24 h,24 h后連續兩次測定其游泳性能及力竭前后的代謝特征,兩次測試的時間間隔為30 min。最后,分析馴化溫度(6、12、18℃)和重復測定(測定I、測定II)及其交互作用對實驗魚快速啟動反應、游泳性能以及力竭后代謝特征的影響。馴化和測試期間,水溫精度控制在±0.1℃。

1.3 快速啟動測定

將單尾實驗魚轉入直徑為1 m的圓形水槽并給予15 min的適應期以消除轉移脅迫。水槽中水深15 cm,水溫與實驗魚馴化溫度一致。為減少外界環境干擾,水槽置于獨立的行為觀測室,觀測室四周避光,水槽正上方3 m處設有一5 W的節能燈,高速攝像機(500幀/s, BASLER A504K, Germany)置于水槽正上方2 m處。通過玩具槍在距離實驗魚尾部約10 cm處射入直徑為0.5 cm的子彈,以刺激實驗魚檢測其快速啟動表現。在子彈射出的同時開啟高速攝像機對實驗魚進行拍攝,拍攝歷時2 s,通過攝像機捕獲的圖像以子彈接觸水面的瞬間作為刺激起始時刻。采用圖像處理軟件(nEO iMAGING和ACDsee 12)對拍攝的圖像進行處理,采用軟件TpsUtil和TpsDig(http://life.bio.sunysb.edu/morph/)將圖像數字化以測量實驗魚質心位移,依據魚體的狀態變化和質心軌跡計算出反應率(Reaction rate,R)、反應時滯(Latency time,Tlatency)、快速逃逸(實驗魚逃離原有位點,質心發生顯著偏移)比例等參數[15,19]。其中,R是對環境刺激有響應的個體數占實驗魚總數的百分比,測定時將對刺激有反應的個體記為1、無反應的個體記為0；Tlatency是指從環境刺激發生到魚體作出可被察覺的行為反應所經歷的時間[15]。

1.4 游泳性能及力竭前后代謝特征測定

1.4.1日常代謝率(Routine metabolic rate, RMR)

式中,DOk和DOk+1分別為測定時間點k及k+1時刻呼吸室內的溶氧水平(mg/L)；V(L)為呼吸室體積與實驗魚體積的差值；t(h)為時間點k與k+1的時間間隔；m(kg)為實驗魚的體重。為了消除體重差異對代謝率測定的影響,將實驗魚體重標準化為1 kg,0.75為體重校正指數[5,31,34]。

1.4.2Ugait和Ucat

RMR測定完成后,將游泳管中的水流速度以0.167 cm/s2的加速度持續增加(游泳管連接計算機,管內的水流速度由編寫的程序控制),直至實驗魚到達運動力竭狀態。將實驗魚首次出現“爆發-滑行”姿態變化且在水流中相對位置上下移動這一行為時的游泳速度記為Ugait,將實驗魚力竭時的水流速度記為Ucat。力竭狀態的評判標準為實驗魚無力前進游泳并停留在游泳管末端篩板20 s以上[23,28,35]。為避免造成低氧脅迫,每次加速測定前短暫打開游泳管后蓋以實現內外水體交換(時長為20 s),然后再密閉游泳管。

1.4.3力竭后代謝特征

Ugait和Ucat測定結束后(實驗魚力竭后),將游泳管內的水流降至12 cm/s(與適應期相同),立即使用溶氧儀對游泳管內水體的溶氧水平進行測定,每1 min測定1次,連續測定30 min,得出實驗魚代謝率隨力竭后恢復時間延長的變化特征。將實驗魚代謝恢復過程中的最大代謝率記為MMR,將MMR與RMR的差值記為MS[28]。實驗魚代謝恢復過程中游泳管內水體溶氧不低于飽和溶氧的80%[5]。

1.5 數據分析

采用SPSS 19.0對數據進行統計分析。首先對實驗數據進行正態性(Shapiro-Wilks檢驗)和方差齊性檢驗。若數據滿足正態性和方差齊性,采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)和Tukey′s HSD多重比較檢驗差異顯著性；若數據不滿足正態性和方差齊性,采用Scheirer-Ray-Hare分析[19]檢驗差異顯著性。數據均以平均值±標準誤表示,顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 溫度和重復測定對實驗魚快速啟動反應的影響

溫度和重復測定對實驗魚的反應率R均無顯著影響(P>0.05,表1,圖1)。溫度對實驗魚的反應時滯Tlatency影響顯著(P<0.05,表1,圖1),Tlatency隨溫度升高而變短。此外,溫度和重復測定對實驗魚快速逃逸比例無影響,前后兩次測試每個溫度處理組均只有1尾魚展現出快速逃逸行為。

表1 溫度和重復測定對秦嶺細鱗鮭快速啟動反應、游泳性能及力竭后代謝特征的影響

圖1 溫度和重復測定對實驗魚快速啟動反應的影響Fig.1 Effects of temperature and repeat measurement on fast-start of Brachymystax lenok tsinlingensisa—c上標字母不同表示首次測定不同溫度組間差異顯著(P<0.05)；x, y無共同上標字母表示重復測定不同溫度組間差異顯著(P<0.05)

2.2 溫度和重復測定對實驗魚游泳性能的影響

溫度對實驗魚的Ugait和Ucat影響顯著(P<0.05,表1,圖2),重復測定對實驗魚的Ugait和Ucat無顯著影響(P>0.05,表1,圖2)。

圖2 溫度和重復測定對實驗魚游泳性能的影響Fig.2 Effects of temperature and repeat measurement on swimming performance of Brachymystax lenok tsinlingensisUgait: 步法轉換速度 Gait transition speed; Ucat: 勻加速游泳速度 Constant acceleration test speed; a-b上標字母不同表示首次測定不同溫度組間差異顯著(P<0.05)；x, y無共同上標字母表示重復測定不同溫度組間差異顯著(P<0.05)

2.3 溫度實驗魚運動前日常代謝率RMR的影響

溫度對實驗魚的RMR影響顯著(P<0.05,表1),RMR隨馴化溫度的升高而升高,6℃、12℃、18℃馴化下的RMR分別為(118.6±10.1)、(151.4±9.11)、(182.0±7.86)mg O2kg-1h-1。

2.4 溫度和重復測定對實驗魚力竭后代謝特征的影響

不同溫度下的實驗魚力竭后的代謝恢復特征見圖3。無論是初次運動后的代謝恢復期I還是再次運動后的恢復期II,實驗魚代謝率都急劇上升達到峰值,隨后快速下降并逐步恢復到運動前水平。溫度對實驗魚的MMR影響顯著(P<0.05,表1,圖4)、對實驗魚的MS無顯著影響(P>0.05,表1,圖4),重復測定對實驗魚的MMR和MS均無顯著影響(P>0.05,表1,圖4)。

圖3 不同溫度下實驗魚力竭后的代謝恢復特征Fig.3 Metabolic recovery after exhaustive swimming in Brachymystax lenok tsinlingensis at different acclimation temperature

圖4 溫度和重復測定對實驗魚力竭后代謝特征的影響Fig.4 Effects of temperature and repeat measurement on metabolic characteristics after exhaustive swimming in Brachymystax lenok tsinlingensisMMR: 最大代謝率 Maximum metabolic rate; MS: 代謝范圍 Metabolic scope； a-b上標字母不同表示首次測定不同溫度組間差異顯著(P<0.05)

2.5 溫度系數Q10

特定溫度范圍內實驗魚不同生理參數的溫度系數Q10見表2。無論是首次測定還是重復測定,相較于6—12℃范圍內生理參數的Q10值,12—18℃范圍內所有生理參數的Q10值均較小。6—12℃范圍內,首次測定Ugait的Q10值小于重復測定、而MMR和MS的Q10值大于重復測定；12—18℃范圍內,首次測定各種生理參數的Q10值與重復測定相近。

表2 秦嶺細鱗鮭不同生理參數的熱敏感性

3 討論

3.1 溫度和重復測定對實驗魚快速啟動的影響

魚類快速啟動游泳的溫度效應與物種的熱敏感性、熱經歷、生理狀態以及生態對策等均有關聯[15,19,36-37]。由于溫度影響機體能量供給和肌肉收縮時間[38],在一定范圍內,魚類的快速啟動游泳能力往往隨著溫度的升高而提升。例如,Yan等[37]發現,采用電刺激下草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鯽魚(Carassiuscarassius)、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)、鳊魚(Parabramispekinensis)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、白甲魚(Onychostomasima)等幾種鯉科魚類的快速逃逸能力(逃逸最大速度、逃逸距離)在25℃下與15℃下相比均顯著提升。誠然,逃逸反應是多數魚類遭遇環境風險刺激時的主要生存對策,但是作為另一種適應性選擇,也有一些魚類會表現出隱匿行為或者驚恐狀的靜息僵直(Freezing behavior)或退縮行為(Withdrawal behavior)[39-40],例如歐洲鰨(Soleasolea)、比目魚(Hippoglossus)等一些隱蔽性強的魚類和具有保護性盔甲的魚類,在遭遇環境刺激時往往采取靜息不動的行為策略以降低被捕食的風險[39]。由于魚類對各種環境刺激方式的敏感性不同,快速啟動的測定方法目前尚未統一。以往研究中,采用電刺激的方法由于重現性較好、易于控制和標準化,并且能夠更準確地檢測魚體逃逸反應動力學參數,在相關研究中被廣泛采用[15,19,36-37],然而其缺點是難以模擬魚類在自然界遭遇的真實環境,生態關聯度不強,并且容易陷入實驗動物倫理的爭議中,近年來已不被該研究領域的多數科學家所接受。本研究采用的刺激方式更為接近自然界真實狀況,因此檢測結果也更能反映動物真實的快速啟動表現。但遺憾的是,該刺激方式僅檢測出了實驗魚的快速啟動反應(認知響應能力)、并不能有效誘導實驗魚的快速逃逸行為(爆發逃逸能力)。作者也曾嘗試采用食物誘導、化學捕食信號等其他方式刺激,效果均不理想。未來研究中,在其野生生境下實測其快速啟動表現可能是必要的。有幸的是,本研究也發現了一些有趣的實驗結果,隨溫度升高,秦嶺細鱗鮭的Tlatency顯著減少,但溫度和重復測定對反應率R和快速逃逸比例均無顯著影響,前后兩次測試每個溫度處理組均只有1尾魚(占比11.1%)展現出快速逃逸行為。由于秦嶺細鱗鮭棲息生境主要為一些亂石底質的山澗溪流、易于隱匿,且其體色與周圍環境相近、不易被發現。我們推測,靜息不動可能是該物種適應于山澗溪流生境、應對低強度機械刺激一種有效的生態策略,為未來的野外生態學研究提供了有益啟示。

3.2 溫度和重復測定對實驗魚游泳性能的影響

魚類游泳性能與溫度的關系通常呈“鐘型”曲線[41-42],在適宜溫度范圍內,游泳性能隨溫度升高而上升。本研究中,溫度對秦嶺細鱗鮭Ugait和Ucat影響顯著,6℃馴化組的Ugait和Ucat低于12℃和18℃馴化組,但18℃和12℃馴化組間并無差異。研究結果與Xia等[5]對秦嶺細鱗鮭臨界游泳速度(Critical swimming speed,Ucrit)的研究結果相一致。此外,由于24℃條件已經對秦嶺細鱗鮭造成了嚴重熱脅迫、導致高死亡率,因此,依據“鐘型”曲線模型,推測秦嶺細鱗鮭游泳性能的最適溫度介于12℃和18℃之間[5]。相較于12—18℃,6—12℃范圍內秦嶺細鱗鮭Ugait和Ucat的溫度系數Q10較高,其熱敏感程度與變化趨勢與Ucrit相似[5]。綜合秦嶺細鱗鮭Ugait、Ucat和與Ucrit對溫度的響應規律來看,該物種游泳性能對溫度變化的敏感性較高。秦嶺細鱗鮭Ugait和Ucrit的值接近[5],二者均顯著小于Ucat(6、12、18℃下Ugait分別為Ucat的62.1%、60.2%、53.2%,Ucrit分別為Ucat的61.2%、65.0%、60.2%),表明與有氧運動能力相比其無氧運動能力相對較強,這可能與該物種棲息的亂石底質生境及其水流環境特點有關。然而,值得注意的是,總體上該物種的運動性能較弱,無論是有氧運動能力還是無氧運動能力均弱于常見淡水魚類,例如鯉科魚類Ucrit一般可達到體長的6—8倍,Ucat通常可達到體長的8—10倍[15],而不同溫度下秦嶺細鱗鮭Ugait和Ucrit均在5倍體長以下,Ucat均在7倍體長以下。提示氣候變化和筑壩等人為活動導致生境水溫和水流變化可能容易對其生存與分布造成限制[33]。

由于生存活動的需要,魚類通常需要多次重復游泳運動[28,43-44]。Jain和Farrell[43]探究了季節溫度變化對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)重復游泳能力的影響,發現低溫(8.4℃)馴化下兩次測定的Ucrit值接近、而較高溫(14.9℃)馴化下測定II的Ucrit值顯著低于測定I,認為高溫下重復游泳能力的降低主要和機體乳酸積累等代謝功能損傷有關。MacNutt等[44]發現,無論是急性(48 h)和亞慢性(21 d)馴化,馴化溫度對克拉氏鮭(Oncorhynchusclarkiclarki)重復游泳Ucrit值的恢復率均無顯著影響。Pang等[28]發現,較低溫度(10、15、20℃)馴化下,中華倒刺鲃測定II和測定I的Ucat值無顯著差異、而高溫(25、30℃)馴化下測定II的Ucat值顯著低于測定I。本研究中,不同溫度下測定I與測定II秦嶺細鱗鮭的Ugait和Ucat無顯著差異,提示該物種游泳性能具備較佳的恢復力和可重復性,研究結果與MacNutt等相近[44]。

3.3 溫度和重復測定對實驗魚力竭前后代謝特征的影響

溫度通過影響外溫動物的生化反應與合成速率顯著影響其代謝水平[45]。魚類RMR通常隨溫度升高而升高[41],但MMR與溫度的關系尚無一致觀點。有研究者認為,MMR與溫度的關系呈“鐘型”曲線[28,41],也有研究者認為MMR與溫度的關系是線性的、隨溫度升高而上升[42]。例如,急性溫度增加可以導致尖吻鱸(Latescalcarifer)MMR持續升高直至38℃(已接近其臨界溫度上限)[46]。本研究中,溫度對秦嶺細鱗鮭的MMR影響顯著,測定I中6℃馴化組的MMR顯著低于12℃和18℃馴化組。低溫下MMR降低主要是由于心鰓循環系統功能下調致機體攝氧能力降低所致[47]。然而,測定II中不同溫度組間MMR的差異性消失,并且6—12℃范圍MMR的Q10值也從測定I中1.64下降到1.27,提示低溫下前期運動鍛煉對動物MMR的提升可能具有積極作用。運動力竭后的代謝恢復包括能量代謝底物的恢復、代謝產物的清除以及內環境(體液酸堿度、滲透壓等)的重新平衡,代謝恢復能力將決定后續加速游泳能力的發揮[48]。值得關注的是,無論初次運動后的恢復期I還是再次運動后的恢復期II,秦嶺細鱗鮭代謝率都急劇上升達到峰值,隨后快速下降并逐步恢復到運動前水平,并且重復測定對其力竭后的代謝參數(MMR和MS)均無顯著影響,暗示該物種具備較佳的代謝恢復能力。

綜上,秦嶺細鱗鮭對低強度機械刺激主要采用靜息而非逃逸的生態策略,高溫下的快速啟動反應更為迅速。秦嶺細鱗鮭游泳性能對溫度變化的敏感性較高,最適溫度估計介于12—18℃。盡管不同溫度處理下,該物種的代謝恢復與重復運動能力較佳,但總體上該物種的游泳性能較弱,提示生境水溫和水流變化可能對其生存與分布造成限制。