覆蓋模式對旱作農田土壤微生物多樣性及群落結構的影響

劉子涵,黃方園,黎景來,張 鵬,楊寶平,丁瑞霞,聶俊峰,賈志寬,*

1 西北農林科技大學農學院, 咸陽 712100

2 中國旱區節水農業研究院, 咸陽 712100

3 農業部西北黃土高原作物生理生態與耕作重點實驗室, 咸陽 712100

作為土壤中最活躍的部分,微生物表現出多樣的代謝功能,直接或間接參與了大量的生物化學反應,在陸地生態系統中起著不可或缺的作用[1-3]。研究表明,微生物群落在調節養分循環、影響植物生產力和生態系統穩定性方面發揮著至關重要的作用[4-6],并且微生物對植被和土壤性質的改變均能迅速做出反應[7-8]。因此,土壤微生物多樣性和群落結構的變化可被作為重要和敏感的指標來表征土壤健康的短期和長期變化[3,9]。

中國北方旱地面積約占全國土地總面積的56%和農業生產的46%[10],是中國農業生產的重要地區之一。然而,水資源短缺、土壤肥力差是限制西北旱作區農業生產的主要因素[11]。因此,如何降低土壤水分蒸發,充分利用有限的自然降水,提高作物對有限水分的利用效率是解決該地區作物產量的關鍵所在。農田覆蓋通過抑制土壤蒸發,極大地提高了作物的水分利用效率,已被廣泛用于提高旱地農業生態系統的生產力[12-17]。但前人研究多集中于農田覆蓋對土壤水分、土壤養分和作物產量的影響,而對農田覆蓋條件下土壤微生物群落的變化了解較少。目前已有部分研究發現農田覆蓋措施通過影響土壤結構、土壤微氣候(土壤水分、土壤溫度等)和土壤養分,可顯著影響土壤微生物群落結構和多樣性。陳月星等[18]、董立國等[19]和Huang等[20]研究表明,地表覆蓋生草或秸稈均顯著影響了土壤細菌群落結構及其多樣性和豐富度。Liu等[8]發現地膜覆蓋處理可顯著改變溫帶半干旱地區土壤真菌群落組成,而侯曉杰等[21]研究表明地膜覆蓋顯著降低了東北黑土地的土壤微生物功能多樣性。然而,現有研究多集中于單一覆蓋材料或模式對土壤細菌或真菌群落結構一方面的影響,不同覆蓋材料或模式間的比較鮮有報道。此外,土壤細菌和真菌群落對農田覆蓋的響應并不一致,因此要了解農田覆蓋對土壤微生物群落結構的影響,需同時研究不同農田覆蓋模式下土壤細菌和真菌群落多樣性和組成的變化。

本研究基于3年連續田間試驗,在西北旱作區的設置了3種不同覆蓋方式：平作地膜覆蓋(P)、平作秸稈覆蓋(S)和壟膜溝播覆蓋(R),以平作不覆蓋為對照(CK)。應用Illumina HiSeq測序技術分析土壤細菌和真菌群落組成和多樣性,比較不同覆蓋模式下的土壤微生物群落的變化,目的是探明連年農田不同地表覆蓋對土壤微生物多樣性和群落組成的影響差異,并結合相關的土壤理化性質(即pH：土壤酸堿度,SM：土壤水分,ST：土壤溫度,SOM：土壤有機質,NO3-N：土壤硝態氮和TN：土壤全氮)變化,明確土壤微生物群落變化與土壤理化性狀之間的關系,從而為西北旱作區農田覆蓋栽培技術的合理應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

本試驗在陜西楊凌西北農林科技大學中國旱區節水農業研究院試驗田(34°20′ N, 108°04′ E)進行。該試驗區海拔466.7 m,多年平均降水量585.0 mm,7月至9月期間多年平均降雨量為380 mm,年蒸發量993.2 mm。年均氣溫13.5℃,年均日照時數為2196 h,無霜期 220天。屬暖溫帶半濕潤易旱區,土壤類型為塿土。0—20 cm土層土壤全氮含量1.21 g/kg,有機質含量11.97 g/kg,全氮含量1.31 g/kg,速效氮含量53.35 mg/kg,速效磷含量21.35 mg/kg,速效鉀含量142.97 mg/kg。容重為1.28 g/cm3。耕作方式為春玉米連作。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機區組設計,設3個覆蓋處理：(1)平作地膜覆蓋(P)：覆蓋方式為平膜全覆蓋,膜寬120 cm；(2)平作秸稈覆蓋(S)：秸稈為玉米秸稈,整稈均勻覆蓋,覆蓋量為9000 kg/hm2；(3)壟膜溝播覆蓋(R): 溝、壟寬均為60 cm,壟高15 cm,其中壟上覆蓋地膜,膜寬70 cm,溝內種植區不進行覆膜；以傳統平作不覆蓋為對照(CK),共4個處理,每個處理3次重復,每個小區面積58.8 m2(14 m×4.2 m)。地膜為聚乙烯塑料地膜(天水天寶塑業有限責任公司生產),厚度0.01 mm。上季作物收獲后,將各覆膜(P、R)處理的舊地膜全部移除,秋季整地后重新覆蓋地膜。覆蓋后沿地膜帶垂直方向每隔200 cm壓一土帶,防大風揭膜。在S處理中,上季作物收獲后,移除不能分解腐爛的秸稈,秋天整地后重新覆蓋秸稈。所有處理覆蓋時間均為秋季作物收獲后(8月中旬)覆蓋。

試驗始于2013年,作物為春玉米,品種為大豐30,于每年4月中下旬進行播種,8月中旬收獲。各處理播種密度均為67,000 株/hm2(行距60 cm,株距25 cm),用鷹嘴播種(施肥)器人工播種,播種深度為4—5 cm。播種時各處理用人工鷹嘴播種(施肥)器施用基肥(N 140 kg/hm2和 P2O5150 kg/hm2),玉米播種后65天后在玉米棵間進行追肥(N 140 kg/hm2),施肥深度為4—5 cm,全生育期不灌水。試驗期間所有處理沒有發生病蟲害,并根據情況進行人工除草。

1.3 土壤取樣

在大田試驗第3年的2016 年7月1日(播后74天,玉米吐絲期)進行取樣,直徑5 cm 的土鉆遠離植物根部以“S”形取樣收集9個重復樣品(0—20 cm土層的土壤),然后混合均化作為每個重復小區的復合樣品。將樣品過2 mm 篩,移除根系和其他其他肉眼可見的雜物。每個樣品分成三部分：一部分鮮土用于硝態氮(NO3-N)的測定；一部分分裝到50 mL 離心管中,立即放入-80℃冰箱中保存,用于土壤微生物 DNA 的提取；剩余土樣風干后用于土壤 pH、土壤有機質(SOM)、土壤全氮(TN)等指標的測定。

1.4 土壤理化性質測定

土壤水分與溫度：取土樣的同時用烘干法測定0—20 cm 土壤水分(SM),每個小區3次重復。同時用地溫計在取樣前后連續3天測定5、10、15、20 cm的土壤溫度(ST),以5—20厘米的土壤溫度的平均值作為每個小區的土壤溫度。

土壤pH：取風干土10 g,按土∶水=1∶2.5 的倍數加入25 mL水后劇烈震蕩搖勻后,靜置 30 min,用 pH 計測定[22]。

土壤養分測定：土壤有機質采用重鉻酸鉀氧化法測定[22]；土壤全氮含量采用凱氏定氮法測定[22]；土壤硝態氮含量采用流動分析儀進行測定：取新鮮土樣5 g,加入50 mL 1.0 mol/L KCl振蕩30 min,然后過濾提取物,使用流動分析儀(Autoanalyzer 3,Bran Luebbe,德國)測定硝態氮濃度。

1.5 DNA提取和Illumina HiSeq測序

土壤微生物DNA使用FastDNA試劑盒(MP Biomedicals, USA)提取。應用帶有barcode的特異引物序列(細菌：341F 5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′和806R 5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′；真菌：F2045 5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′和R2390 5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′)擴增相應土壤細菌16S rRNA V3-V4區域和真菌ITS基因。擴增體系包括：2×KAPA HiFi Hotstart ReadyMix15 μL,正反向引物各1 μL,10 ng DNA模板,最后用dd H2O補足至30 μL。PCR擴增條件為：95℃預變性3 min；然后94℃變性20 s,58℃退火30s,72℃延伸30 s持續24個循環；最后72℃延伸150 s結束。

擴增子使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)從2%瓊脂糖凝膠中提取并使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Promega,USA)純化DNA。將純化的擴增子以等摩爾濃度合并,然后根據標準方案在Illumina HiSeq PE250平臺上進行配對末端測序(2×250 bp)。Illumina HiSeq 測序在上海銳翌生物科技有限公司完成。PANDAseq軟件用于合并來自原始DNA片段的配對序列讀數[23]。使用USEARCH v5.2.32對序列進行進一步分析,通過聚類相似序列的差異小于3%來過濾和去噪數據。對微生物生態學管道軟件的定量分析被用來通過將聚類OTUs的讀數組合為97%相似性來選擇操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)[24]。

1.6 數據分析

采用單因素方差分析法分析土壤理化性狀,以確定處理之間的差異(顯著差異在95%的置信水平下確定)。當檢測到顯著性時(P<0.05水平),使用鄧肯法進行多重比較。使用QIIME軟件計算阿爾法多樣性。用Chao1估計法和Shannon多樣性指數計算細菌群落估計的豐富度和多樣性。使用Canoco 5.0軟件進行冗余分析(Redundancy analysis, RDA),以辨別微生物群落組成與環境參數之間的相關性。在RDA中選擇manual forward selection程序以使用具有999個排列的蒙特卡羅測試來確定環境變量參數的顯著性。Spearman的等級相關性用于測試微生物群落組成與土壤理化性質之間的關聯。使用SPSS18.0(SPSS Inc., Chicago,IL,USA)進行所有統計分析和Spearman等級相關性分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

連續覆蓋3年后,各處理的土壤理化性質發生了顯著變化(表1)。覆蓋處理(P、S和R)顯著降低了土壤pH(P=0.01)；與CK相比,R和S處理TN和NO3-N含量(P<0.01)分別顯著提高12.84%、7.96%和14.95%、25.13%,而P處理下玉米營養生長旺盛,過度消耗地力,土壤TN含量較CK顯著降低5.08%；覆蓋模式對SOM影響不顯著,各處理下土壤SOM含量在15.00—15.58 mg/kg；P和R處理均顯著提高了SM和ST,春玉米產量較CK分別顯著提高 17.4%和16.69%(圖1)。秸稈覆蓋對SM、ST和產量影響不顯著。

圖1 不同覆蓋處理的玉米產量

表1 0—20 cm土層土壤理化性質

2.2 土壤微生物群落多樣性及與土壤理化特性的關系

采用操作分類單元(OTU)水平方法計算不同覆蓋條件下微生物群落豐富度和多樣性(表2)可知, 各覆蓋處理(P,S和R)下土壤細菌的OTU、Chao1指數和Shannon多樣性指數較CK 處理均有提高。而真菌豐富度和多樣性對覆蓋模式的響應不同,除P處理外,其他覆蓋處理(S和R)的Chao1指數、OTU和Shannon多樣性指數均顯著高于CK,而P處理下土壤真菌多樣性和豐富度與CK處理相比差異不顯著。Spearman相關系數分析表明,細菌群落的OTU和Shannon多樣性指數與SM均呈顯著正相關,OTU和Chao1指數與NO3-N含量呈極顯著正相關；真菌群落的OTU、Chao1指數和Shannon指數均與ST呈顯著負相關,和TN、NO3-N含量均呈顯著正相關(圖2)。

圖2 土壤微生物多樣性與環境因子的斯皮爾曼相關系數

表2 不同覆蓋處理土壤微生物的豐富度和多樣性指數

2.3 土壤微生物群落結構及與土壤理化特性的關系

通過對所有土壤樣品進行質量測序,細菌群落和真菌群落分別獲得143025和139826個序列。每個樣本的細菌序列數量為33155—38411(平均值= 35756),而真菌序列的數量為33438—36800(平均值= 34957)。由圖3可知,細菌的優勢門是變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria),它們的相對豐度范圍分別為28.92%—30.55%、25.66%—30.48%和17.85%—27.3%。真菌群落的優勢門是子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和接合菌門(Zygomycota),它們的相對豐度范圍分別為49.78%—64.36%,13.52%—33.44%,5.55%—7.75%和3.93%—10.27%。另外,在所有樣品中均發現了低豐度的壺菌門(Chytridiomycota)。

圖3 不同處理土壤微生物群落在門分類水平下的組成和相對豐度

此外,Spearman等級相關分析(表3)表明土壤理化特性顯著影響了微生物群落組成。在細菌群落組成中,酸桿菌門的相對豐度與TN、NO3-N和SOM呈顯著正相關,與pH呈顯著負相關。芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和擬桿菌(Bacteroidetes)的相對豐度均與TN呈顯著正相關。此外,NO3-N也和擬桿菌呈顯著正相關。對于真菌群落而言,ST顯著影響擔子菌門和接合菌門,并與前者呈顯著正相關,后者與之相反。球囊菌門與TN和NO3-N呈顯著正相關,與pH則呈顯著負相關。壺菌門的相對豐度與SM呈顯著正相關。由此可知土壤溫度和氮含量是改變微生物群落組成的主要因素。

表3 土壤微生物(門分類水平)的群落組成與土壤理化性質的Spearman等級相關系數

采用冗余分析(RDA)進一步分析各土壤環境因子與微生物群落結構之間的關系。圖4為細菌群落結構與土壤理化性質之間的關系,蒙特卡洛置換檢驗表明(表4),土壤SM(F=10.1,P=0.001)、ST(F=4.5,P=0.012)和TN(F=3.7,P=0.025)是細菌群落變異的三個最重要的貢獻者。所有的環境變量共同解釋了樣本間細菌群落變異的86.7%,影響大小順序為SM>ST>TN>NO3-N>pH>SOM。RDA的前兩個排序軸分別解釋了總方差的59.96%和16.63%。在第一個排序軸上,來自P處理樣品點的聚集度與其余處理的樣品點的聚集度相距較遠。圖4為真菌群落結構與土壤理化性質之間的關系,影響真菌群落組成最大的土壤理化性質為SM(F=6.2,P=0.004)(表4)。所有的環境變量共同解釋了樣本間真菌群落變異的83.4%,影響的順序為 SM>TN>ST>NO3-N>pH>SOM。RDA的前兩個排序軸分別解釋了總方差的51.9%和26.6%,在第一個排序軸上,CK和S處理的樣品點距離較近,來自P和R處理樣品點的聚集度與它們相距較遠。

圖4 土壤微生物群落結構與土壤理化特性的冗余分析(RDA)

表4 環境變量對土壤微生物群落分布的貢獻及其顯著性

3 討論

3.1 覆蓋對土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物可以敏感地指示氣候和土壤環境條件的變化[3,9],同時土壤微生物多樣性受土壤養分、結構、pH、溫度和水分等條件的影響[2]。前人研究發現,秸稈覆蓋、麥草覆蓋以及集雨地膜覆蓋均有利于維持土壤微生物多樣性,提高土壤微生物群落的豐富度和群落物種的均勻度[18,25-26]。本研究發現各覆蓋處理(秸稈覆蓋:S、壟膜溝播覆蓋:R、地膜覆蓋:P)均顯著提高了土壤細菌多樣性和豐富度,而不同覆蓋措施對土壤真菌多樣性影響不同(表2),這主要與土壤理化性質的變化有關。我們發現土壤細菌多樣性主要受土壤水分的影響(圖2),水分通過改變微生物的細胞滲透狀態、土壤基質有效性、pH值、氣體擴散和溫度等直接或間接影響土壤微生物的多樣性,微生物尤其是細菌在相對較高的水勢環境下活性更高[27-28]。而本試驗中的各覆蓋處理(P、S和R)均能有效改善半干旱區的土壤水分條件(表1),為土壤細菌的生長提供了一個穩定而潮濕的環境促進其生長和繁殖。覆蓋措施對微生物豐富度的積極影響可能還要得益于某些優勢菌門的豐度增加,如酸桿菌門(Acidobacteria)和球囊菌(Glomeromycota)(圖3),這表明覆蓋措施促進了微生物在選擇性方向上發育。此外本試驗還發現,與細菌相比,秸稈覆蓋和壟膜溝播種植方式會導致微生物群落α多樣性中更高的真菌優勢(表2)。這是因為土壤真菌比細菌具有更廣的適應性和多功能性[29],由于真菌擅長分解有機物,壟溝結構促進了作物根系的生長從而分泌更多的有機物[26],秸稈覆蓋植物殘渣持續的碳氮輸入,這些都優先刺激了真菌的生長和增殖,真菌豐富度的增加又使其分解有機物能力更強,由此形成良性循環,這有利于農業系統中土壤SOM穩定和土壤健康[30]。對于土壤真菌群落多樣性和豐富度而言土壤溫度是主要影響因素,且二者之間呈顯著負相關(圖2,圖4),這表明當土壤溫度推到微生物活動的最適值以上時會限制其生長繁殖[31-33],因此地膜覆蓋(P)處理下較高的土壤溫度在一定程度上限制了土壤真菌的生長[34]。相比之下,僅用塑料薄膜覆蓋壟部的R處理下的土壤部分熱量會從溝中裸露部分逸散出來,為土壤真菌群落的生長提供了更適宜土壤溫度。而秸稈覆蓋(S)對土壤真菌群落多樣性和豐富度的積極作用還要歸因于玉米秸稈腐解后有機物可以歸還土壤并以此補充土壤有機碳氮養分,為土壤真菌提供了豐富的碳源和氮源[35-36]。此外,土壤養分也是影響土壤微生物(細菌和真菌)多樣性的另一主要因素,由于本試驗所處地區降水時空分布不均,土壤缺水時植物會受到脅迫而改變其對地下的碳分配,影響作物與微生物之間的競爭策略,進而改變土壤微生物多樣性[37-38]。相關性分析表明土壤微生物多樣性與土壤養分(TN和NO3-N)呈顯著正相關,壟膜溝播(R)處理的壟溝結構促進了作物根系的生長從而分泌更多的有機物[13,26],以及秸稈覆蓋下凋落物持續的碳氮輸入均為土壤微生物群落生長創造了良好的土壤養分環境。P覆蓋處理下較高的土壤水分和土壤溫度促使作物旺長,消耗了大量的土壤養分,使土壤微生物和作物競爭有限的礦化養分[39],不利于土壤微生物群落的發展。因此,S和R處理土壤均同時提高了土壤細菌和真菌群落多樣性和豐富度,而P處理下土壤真菌群落多樣性和豐富度與對照處理無顯著性差異。這些都是農田覆蓋引起的土壤微環境的改變,最終導致的土壤微生物多樣性的差異[40]。

3.2 覆蓋對土壤微生物群落結構的影響

本研究發現農田覆蓋措施顯著影響了土壤微生物群落的組成,所有樣品中土壤細菌群落中的優勢種群為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)。同樣,金志薇等[41]、Lipson等[42]和陳月星等[17]研究發現放線菌門和變形菌門也是高寒草地、高山和果園土壤環境中最常見的類群。此外我們發現各覆蓋處理(P、S和R)下變形菌門和酸桿菌門的相對豐度均高于對照(圖3),這是由于變形菌作為一種嗜營養菌,富碳環境可刺激其快速增長[43],因此農田覆蓋條件下土壤中豐富的SOM和NO3-N為變形菌提供了充足的代謝底物促進了其生長和繁殖；酸桿菌被認為可分解難降解的碳源,對于分解植物殘渣來分泌β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶起著重要作用[44],各覆蓋處理下較低的pH和豐富的碳氮養分刺激了酸桿菌的生長,進而會加速土壤中現有碳源的分解[44-46]。放線菌已被發現廣泛分布在陸地生態系統中,特別是在干旱土壤中。各覆蓋處理(P、S和R)的放線菌相對豐度均低于CK,這可能是由于地表覆蓋抑制了土壤水分蒸發,增強了儲水能力,因此放線菌門的相對豐度在土壤含水量較低的CK中最高。

本研究中真菌群落以子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)為主,二者作為腐生菌是復雜化合物的重要分解者,對分解植物殘體和降解秸稈殘留物具有重要作用[47-48]。其中R處理下子囊菌門相對豐度較低,與NO3-N含量呈負相關,這與李瑞霞等[49]研究結果一致。此類別中的大多數物種在土壤生態系統中反硝化作用中起重要作用,影響土壤碳的分解, R處理中較低的子囊菌門相對豐度反而會反硝化過程中產生較少的溫室氣體N2O,可能有利于生態圈平衡[45]。與之相反,擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度在R處理土壤中比較豐富,遠高于其他處理,表明壟膜溝播覆蓋為擔子菌的生存提供了良好的棲息環境。有研究表明擔子菌可以與植物形成外生菌根,加速了作物根系對水分和養分的吸收[46],有益于作物產量的形成。我們的試驗結果也顯示R處理產量為所有處理最高(圖1)。球囊菌(Glomeromycota)可構成陸生植物的叢枝菌根,形成菌根的球囊菌廣泛的分布在全世界的土壤中,它和植物的根形成共生關系,促進根部養分吸收和生長,對提高植物抗旱性、耐澇性、耐鹽性以及植物對害蟲和病原體的抵抗力發揮著重要作用[50-52]。本研究發現各覆蓋處理(P、S、R)下土壤中球囊菌門的相對豐度均大于CK,這是由于土壤中較低的pH和豐富氮含量有利于球囊菌的生長[53]。因此,本研究認為,覆蓋模式通過改善土壤水溫和氮含量,改變了微生物的群落結構,微生物群落反過來調節作物對土壤水分和養分的吸收利用,促進了作物的生長發育,最終各覆蓋處理玉米產量較CK均有不同程度提高。P處理雖然顯著提高了玉米產量,但是由于該處理作物對土壤養分的過度消耗,導致土壤氮含量較低(表1),不利于土壤的可持續利用。R和S 處理均提高了微生物多樣性,有利于維持長期的土壤健康。而S處理雖然改善了作物根區的土壤水分條件,但是秸稈覆蓋下較低的土壤溫度抑制了微生物對養分的轉化和供給,限制了種子的萌發、根莖葉的形成乃至生殖生長的進程,導致土壤營養狀況雖然良好而作物產量和CK差異并不顯著。R處理下適宜的土壤水分和溫度為微生物提供了良好的生存環境,有利于土壤養分的釋放,作物產量顯著提高。

4 結論

農田覆蓋顯著改變了土壤理化性質(pH,TN,NO3-N,SM和ST),且與土壤微生物群落密切相關,分別解釋了細菌群落86.7%和真菌群落83.4%的變化。土壤水分是對微生物多樣性影響貢獻率最大的理化因子,地表覆蓋通過提高土壤水分含量增加了土壤微生物多樣性。微生物群落組成變化主要受SM、ST、NO3-N及TN含量的影響,地表覆蓋下較高的NO3-N含量提高了土壤中酸桿菌門(Acidobacteria)和球囊菌(Glomeromycota)的相對豐度；秸稈覆蓋降低了ST,抑制了擔子菌門(Basidiomycota)的生長繁殖。與其他覆蓋處理相比,壟膜溝播處理(R)提高了土壤細菌和真菌的豐富度與多樣性,增加了部分有利于作物生產菌門(酸桿菌門、球囊菌、擔子菌門)的相對豐度,春玉米產量為所有處理中最高。因此,建議采用壟膜溝播(R)作為該地區的種植方式。