高產(chǎn)那西肽活躍鏈霉菌的高通量選育

張小朋,陳貴才,嚴(yán)發(fā)杰,郭李坤,曾偉主,周景文*

1(甘肅匯能生物工程有限公司,甘肅 武威,733000) 2(浙江匯能生物股份有限公司,浙江 海寧,314422) 3(生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)

那西肽(nosiheptide)又稱諾西肽,是一類含有多個(gè)噻唑環(huán)的硫多肽類抗生素,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有良好的抑制作用[1-2],具有不易被分解、用量低、抑菌范圍廣和不易殘留等特性,被廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)中。在動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi),那西肽能夠持續(xù)地對(duì)腸道中的菌群生態(tài)進(jìn)行微調(diào)控,且具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用,被認(rèn)為是一種非常好的新型非吸收動(dòng)物添加劑[3-4]。目前,那西肽主要以發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn),其生產(chǎn)菌株主要為活躍鏈霉菌(Streptomyesactuosus)、抗生素鏈霉菌(Streptomyesantibiotics)和青灰色鏈霉菌(Streptomyesglaucogriseus),以活躍鏈霉菌的生產(chǎn)效果最佳[5-6]。

那西肽是一種次級(jí)代謝產(chǎn)物,具有復(fù)雜的合成途徑。已有研究針對(duì)其合成機(jī)制和作用功能進(jìn)行解析,另外,通過(guò)代謝工程等策略提高了那西肽效價(jià)[7-9]。目前工業(yè)上提高那西肽效價(jià)的方法主要為誘變育種和發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化[10-12]。常用的誘變育種方法包括物理誘變和化學(xué)誘變等方法。刑新會(huì)等[13]開(kāi)發(fā)了一種常壓室溫等離子體誘變育種技術(shù)(atmospheric and room temperature plasma,ARTP),該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、突變效率高等優(yōu)勢(shì),已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、放線菌、微藻、真菌、酵母等微生物。ARTP技術(shù)在阿維菌素、鹽霉素和頭孢菌素等抗生素高產(chǎn)菌株的篩選中取得了較好的效果[14-16]。然而,在篩選過(guò)程中大多數(shù)采用基于隨機(jī)篩選或抗性平板的篩選方法,存在工作量大、周期長(zhǎng)、效率低及成本高等缺點(diǎn)[17-18]。近年來(lái),具有自動(dòng)化、規(guī)模化和微型化的優(yōu)勢(shì)的高通量篩選方法(high-throughput screening,HTS)的興起,為那西肽等次級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的高效篩選提供了平臺(tái)[19-20]。

依據(jù)那西肽的分子結(jié)構(gòu)特性,其與FeCl3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成的配合物,在520 nm可見(jiàn)光下能被快速檢測(cè),基于此建立了一種高通量篩選方法。本研究利用ARTP誘變育種方法處理那西肽工業(yè)生產(chǎn)用菌株活躍鏈霉菌11-27,結(jié)合建立的高通量篩選方法篩選高產(chǎn)那西肽突變菌株,并考察其遺傳穩(wěn)定性和在50 m3工業(yè)發(fā)酵罐中的生產(chǎn)性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

活躍鏈霉菌Streptomycesactuosus11-27為甘肅匯能生物工程有限公司工業(yè)化生產(chǎn)那西肽用菌株。

1.1.2 主要試劑和儀器

玉米淀粉、α-淀粉酶、黃豆餅粉、玉米漿、蛋白胨、豆油等,甘肅匯能生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ARTP誘變育種儀,無(wú)錫思清源生物科技有限公司；FE20K pH計(jì),瑞士Mettler-Toledo公司；FREEDOM EVO移液工作站,瑞士Tecan公司；QPix 420智能挑菌儀,美國(guó)Molecular公司；Cytation3酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek公司；Allegra X-15R離心機(jī),美國(guó)Bekman公司；Eppendorf 5424高速離心機(jī),美國(guó)Eppendorf公司；高效液相色譜儀,Shimadzu Corporation公司；50 m3發(fā)酵罐,浙江科美制藥機(jī)械有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉20,蛋白胨5,KNO31.0,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,NaCl 0.5,CaCO35,瓊脂20；pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉20,黃豆餅粉10,玉米漿20,(NH4)2SO42,CaCO35；pH 6.6～6.8,121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉80,α-淀粉酶0.1,黃豆餅粉30,硫酸銨2,NaCl 2；KH2PO40.5,豆油5,CaCO35,121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

用無(wú)菌生理鹽水從新鮮成熟的活躍鏈霉菌茄子瓶斜面上洗下一定量孢子,加入玻璃珠,振蕩30 min后經(jīng)脫脂棉、漏斗進(jìn)行過(guò)濾,梯度稀釋,將孢子懸液濃度調(diào)整至106～107個(gè)/mL,取1 mL孢子懸液于1.5 mL EP管中備用。

1.2.2 ARTP誘變

采用ARTP技術(shù)對(duì)出發(fā)菌株11-27進(jìn)行誘變處理。取10 μL制備好的孢子懸液均勻涂布于無(wú)菌載片表面。然后將載片置于ARTP誘變育種系統(tǒng)的載臺(tái)上,在入射功率為100 W、氦氣流量為10 SLM條件下,分別照射0、20、40、60、80、100、120、140和160 s。樣品處理完畢后,用鑷子將載片轉(zhuǎn)移至裝有1 mL無(wú)菌生理鹽水的EP管中振蕩重懸1 min,將附著在載片上的孢子充分洗脫形成孢子懸液。

1.2.3 致死率測(cè)定

將ARTP不同照射時(shí)間處理后的單孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋,取10-4、10-5梯度的0.2 mL孢子懸液涂布在固體分離平板培養(yǎng)基上(每個(gè)梯度進(jìn)行3組重復(fù)),于溫度為28 ℃、濕度50%～60%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d,分別統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的菌落個(gè)數(shù),按照公式(1)計(jì)算致死率：

(1)

式中：U，對(duì)照組長(zhǎng)出的平均菌落數(shù)；T，用ARTP技術(shù)處理后長(zhǎng)出平均菌落數(shù)。

1.2.4 高通量篩選

應(yīng)用QPix 420智能挑菌儀將成熟后的單菌落挑選于含有800 μL液體培養(yǎng)基的96深孔板中,在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)28 h,以10%的接種量轉(zhuǎn)接于含有1 mL液體篩選培養(yǎng)基的48深孔板中,在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)4 d后,加入1 mL無(wú)水乙醇37 ℃保溫30 min,4 000 r/min離心15 min,取一定體積上清液,加入等體積無(wú)水乙醇,搖勻,取120 μL上述含有那西肽的樣品液于96淺孔板中,再加入80 μL 10 mmol/L的FeCl3溶液,靜置10 min后,用酶標(biāo)儀檢測(cè)520 nm處的吸光值,吸光值越高表明那西肽含量越高,挑取高于對(duì)照5%以上的優(yōu)勢(shì)菌株復(fù)篩。

將孔板初篩選取的優(yōu)勢(shì)菌株接種試管斜面,于28 ℃,濕度50%～60%培養(yǎng)7 d,成熟后轉(zhuǎn)接至搖瓶種子液中,28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)28 h,10%接種量接入搖瓶發(fā)酵液中,于28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)6 d,檢測(cè)效價(jià),挑取高于對(duì)照10%以上的優(yōu)勢(shì)菌株。

將搖瓶復(fù)篩選取的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng),并進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè),將確定了遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)菌株砂土保藏。

1.2.5 高通量檢測(cè)

高通量檢測(cè)那西肽含量是通過(guò)全自動(dòng)移液工作站將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至96孔淺孔板中,加入FeCl3溶液,用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD520處吸光值,吸光值越高表明那西肽含量越高。

1.2.6 液相檢測(cè)條件

采用高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中那西肽的含量。色譜柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V[水(0.025%磷酸)]=50∶50；流速：1 mL/min；柱溫：26 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死率曲線

ARTP誘變育種技術(shù)中所用的等離子體射流能打斷細(xì)胞內(nèi)C-N鍵、氨基鍵和P-O鍵,會(huì)導(dǎo)致大部分微生物死亡,但少部分會(huì)通過(guò)自身修復(fù)系統(tǒng)而存活下來(lái),從而導(dǎo)致基因突變[21]。活躍鏈霉菌經(jīng)ARTP誘變處理的致死率如圖1所示,菌株致死率隨誘變時(shí)間的增加而增加,當(dāng)處理時(shí)間為30 s時(shí),菌株已經(jīng)受到明顯損傷,致死率達(dá)60%；當(dāng)處理時(shí)間從30 s增加至40 s,致死率從60%急劇增加到90%；當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)70 s后,菌株的致死率接近100%。

圖1 ARTP誘變致死曲線Fig.1 The lethality curve of ARTP treatment

研究報(bào)道ARTP誘變處理的致死率在90%以上的突變效果較好[22]。因此,本研究選取40～60 s間之的時(shí)間作為后續(xù)的誘變處理時(shí)間。

2.2 高通量篩選方法的建立

目前,那西肽常用的檢測(cè)方法包括高效液相色譜法、分光光度法。高效液相色譜法檢測(cè)精準(zhǔn)性高、范圍廣,但并不適用于高通量篩選檢測(cè)；分光光度法操作步驟繁瑣,處理時(shí)間長(zhǎng),檢測(cè)方法存在準(zhǔn)確度不高和重復(fù)性較差等問(wèn)題[23]。那西肽為sp雜化化合物,具有的羥基與sp2雜化的C原子相連,易與FeCl3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),生成的絡(luò)合物在某一特定波長(zhǎng)下具有較大的響應(yīng)值。通過(guò)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)在,該絡(luò)合物在520 nm可見(jiàn)光處的響應(yīng)值更高。為了選擇出最合適的FeCl3添加量(母液濃度為10 mmol/L),比較了200 μL總反應(yīng)體系中加入不同比例FeCl3溶液(VFeCl3母液∶V總體積,20∶200、40∶200、60∶200、80∶200、100∶200、120∶200)對(duì)檢測(cè)方法的影響,靜置10 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD520(檢測(cè)過(guò)程那西肽的終質(zhì)量濃度分別為0、125、250、375、500、625和750 μg/mL)。結(jié)果如圖2所示,當(dāng)FeCl3的加入體積比例為80∶200時(shí),檢測(cè)方法的線性化程度最佳,其線性方程為：Y=6.770 3×10-4X+0.369 8,R2=0.994 6。

FeCl3加入體積與總體積之比；a-20∶200；b-40∶200；c-60∶200；d-80∶200；e-100∶200；f-120∶200圖2 總體系中不同F(xiàn)eCl3溶液體積比的對(duì)比Fig.2 Comparison of different adding ratio of FeCl3 solution to the total system

2.3 高產(chǎn)菌株的高通量篩選

QPix 420微生物智能篩選系統(tǒng)和移液工作站具有準(zhǔn)確、快速、靈敏、高通量和多參數(shù)同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn),已應(yīng)用于工業(yè)微生物的高通量篩選過(guò)程,從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)良菌株的高效篩選[20]。本研究應(yīng)用ARTP誘變處理那西肽工業(yè)生產(chǎn)菌株11-27,共進(jìn)行3輪次誘變處理,構(gòu)建了共有14 400株菌(96×150)的突變菌庫(kù)。應(yīng)用建立的高通量篩選方法從突變菌種庫(kù)中篩選出125株那西肽含量提高的突變菌株(圖3)。繼續(xù)對(duì)這125株突變菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩,以10%接種量轉(zhuǎn)接至25 mL篩選培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)6 d,高效液相色譜法檢測(cè)那西肽量。結(jié)果如圖4所示,其中有6株生產(chǎn)那西肽含量提升10%以上的突變株,分別為16-7D8、10-2F3、12-6G8、19-1F9、22-3B6、20-5D4,那西肽的效價(jià)較出發(fā)菌株11-27分別提高了10.3%、11.5%、12.0%、10.7%、13.7%、12.8%。

圖3 ARTP誘變初篩Fig.3 Primary screening with ARTP mutation

圖4 搖瓶復(fù)篩Fig.4 Second screening in the shake flasks

2.4 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

為了驗(yàn)證突變菌株的遺產(chǎn)穩(wěn)定性,對(duì)ARTP誘變處理后獲得的6株高產(chǎn)菌株進(jìn)行連續(xù)傳代8次,以工業(yè)出發(fā)菌株11-27為對(duì)照。對(duì)其中第1代、第4代和第8代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,檢測(cè)突變菌株的發(fā)酵特性。結(jié)果如表1所示,傳代至第4代時(shí),突變體積累那西肽的含量基本沒(méi)大變化。傳至第8代時(shí),所有突變菌株積累的那西肽的含量與第1代和第4代的含量基本相當(dāng)。搖瓶驗(yàn)證結(jié)果表明6株高通量篩選獲得的突變菌株具有穩(wěn)定的遺傳特性。

表1 突變菌株遺傳穩(wěn)定性Table 1 The genetic stability of mutant strains

2.5 高產(chǎn)菌株的生產(chǎn)發(fā)酵驗(yàn)證

將那西肽效價(jià)提高最顯著的誘變株22-3B6繼續(xù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)驗(yàn)證。菌株活化后在50 m3罐發(fā)酵生產(chǎn)16批次,發(fā)酵200 h后,發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理提取干燥后檢測(cè)效價(jià),生產(chǎn)過(guò)程以原始菌株11-27為對(duì)照。結(jié)果如圖5所示,誘變菌株22-3B6生產(chǎn)16個(gè)批次的那西肽的平均效價(jià)為5 272 μg/mL,相比對(duì)照株11-27(4 788 μg/mL),其效價(jià)提高了10.1%,生產(chǎn)過(guò)程的轉(zhuǎn)化效果提升明顯。

圖5 突變菌株22-3B6的生產(chǎn)驗(yàn)證Fig.5 Industrial verification of mutant 22-3B6

3 結(jié)論

那西肽是一類典型的可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的含硫類抗生素,由于其安全、低毒性、無(wú)殘留和促生長(zhǎng)等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑中[24-25]。目前,那西肽的生產(chǎn)主要以活躍鏈霉菌發(fā)酵法生產(chǎn)。近年來(lái),研究人員通過(guò)誘變育種、基因組重排、那西肽合成前導(dǎo)肽的改造和發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化與控制等策略提高了那西肽的效價(jià)[26-27]。但由于篩選通量低和人工負(fù)擔(dān)重的限制,那西肽優(yōu)良工業(yè)生產(chǎn)菌株的獲得仍面臨許多挑戰(zhàn)。

本研究基于那西肽分子雜化的特征,其與FeCl3形成的絡(luò)合物在可見(jiàn)光520 nm處具有較明顯的響應(yīng)值,構(gòu)建了一種用于篩選那西肽高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法。結(jié)合ARTP誘變育種技術(shù),從14 400株突變菌株中篩選出6株那西肽效價(jià)明顯提高的突變菌,檢測(cè)該6株菌在合成那西肽方面具有較高的遺傳穩(wěn)定性。最終,將優(yōu)良菌株22-3B6在50 m3發(fā)酵罐中進(jìn)行生產(chǎn)性能的驗(yàn)證,結(jié)果表明,與原始菌株相比,22-3B6積累那西肽的效價(jià)提高了10.1%。本研究應(yīng)用ARTP誘變技術(shù)和高通量篩選技術(shù),高效、快速地獲得了高產(chǎn)那西肽的突變菌株,表明應(yīng)用突變菌株能有效降低那西肽的生產(chǎn)成本,增強(qiáng)企業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力。近年來(lái),通過(guò)基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等生物信息學(xué)技術(shù)解析了鏈霉菌合成那西肽的合成基因簇,并應(yīng)用代謝工程手段強(qiáng)化了菌株中那西肽的合成[28-29]。另外,合成生物學(xué)技術(shù)的興起為強(qiáng)化抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成帶來(lái)了機(jī)遇。因此,在后續(xù)研究中,可繼續(xù)采取流式細(xì)胞分選、重離子誘變、基于代謝工程和合成生物技術(shù)的理性改造以及基于微型反應(yīng)器優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程等策略進(jìn)一步提高活躍鏈霉菌生產(chǎn)那西肽的能力。