靜電噴霧干燥微囊化乳雙歧桿菌BL03

姜甜,陸文偉, 2,崔樹茂,張灝, 2, 3,趙建新, 2*

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫, 214122)2(江南大學(揚州)食品生物技術研究所,江蘇 揚州, 225004) 3(江南大學國家功能食品工程技術研究中心,江蘇 無錫, 214122)

根據FAO/WHO(2002)的定義,益生菌是指由單一或多種微生物組成的活菌,當攝入一定數量時,能通過改善宿主微生態平衡而促進機體健康[1]。活菌數是評價益生菌產品質量的一個重要指標,一般認為攝入益生菌數量至少應在106～107CFU/g才能在宿主機體腸道中定殖并發揮益生功能[2]。因此,如何提高益生菌在制備和貯存期間以及在進入機體后的存活率十分關鍵,益生菌的微囊化己被證明是提高益生菌存活率和胃腸道耐受性最好的方法之一。國內外已有眾多學者在利用微囊化技術提高益生菌的抗逆性方面做了大量研究工作[3]。將雙歧桿菌制成微膠囊是最有效、最有前景的一種方法[4],良好的微膠囊條件可使活性雙歧桿菌安全通過外界環境、胃液等不利因素到達腸道,從而增加腸道中有效雙歧桿菌的數量[5-6],同時可實現其在腸道中的精準緩釋[7]。

微囊化技術是指利用天然或合成的高分子材料作為壁材,將固體、液體或氣體等芯材包埋在生物相容性或可生物降解的聚合物基質或殼體內的一類技術[8]。在食品加工領域,微囊化技術可顯著提高益生菌在加工過程中的存活數量,從而增強酸乳及其制品、果汁和風味面包等的保健功能[9-10]；在農業生物技術領域,微囊化技術可用于生產獸用口服疫苗,刺激動物機體產生黏膜免疫應答[11]。

目前,在食品行業中,研究和應用比較成熟的微膠囊化技術有擠壓法、乳化法和噴霧干燥法[12]。但是,擠壓法囊徑較大,規模化生產難度高；常規乳化法對璧材的要求比較高,而且微囊化顆粒較大。噴霧干燥法是將芯材分散于囊壁材料的稀溶液中,再經較高溫度下溶劑迅速蒸發而使壁材析出成囊。傳統噴霧干燥法存在2個缺點：一是蒸發溫度高且暴露在有機溶劑或空氣中,活性物質易失活,特別是活性益生菌原料；二是由于溶劑的快速除去,囊壁上易有縫隙,致密性差,但這些缺陷在低溫操作下可避免[13]。鑒于微囊化對益生菌活性的保護作用,結合擠壓法、乳化法和傳統噴霧干燥法的優缺點,本文首次研究新型靜電噴霧干燥法制備微囊化益生菌,優化保護劑組成和微囊化工藝,并與傳統噴霧干燥法和乳化法進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳雙歧桿菌BL03(BifidobacteriumlactisBL03)，江南大學；海藻糖、膽鹽，Amresco公司；CaHPO4,中國醫藥集團；麥芽糊精,羅蓋特；MRS培養基,北京奧博星；胃蛋白酶(10 000 U/g)、胰蛋白酶(250 U/g),美國Sigma公司；亞麻酸,陜西晨明生物；阿拉伯膠,安徽宏通生物；脫脂乳粉,新西蘭恒天然；海藻酸鈉,河南優元生物；β-環糊精,華興生物化工；解囊液：Na2HPO4·12H2O溶液35.8 g/L,檸檬酸溶液10.5 g/L,pH 7.4,滅菌備用；無菌生理鹽水：8.5 g NaCl稀釋到1 000 mL,滅菌備用。

1.2 儀器與設備

PolarDry Model 050 Electrostatic Spray Dryer,Fluid Air；Smart Coater DII-29030SCTR、SEM JCM-7000臺式掃描電子顯微鏡,日本JEOL；數顯生化培養箱,金壇市新航儀器廠；238210型超凈工作臺, 蘇凈集團；分析天平,上海精密天平儀器廠；SPRAYDRIVER SD204噴霧干燥器,英國Armfield；FD-1A-80真空冷凍干燥機,北京博醫實驗儀器；RC25C低溫高速離心機,美國Sorvall instruments DuPont；FE20/EL20 pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)；mLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋,日本SANYO。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

將乳雙歧桿菌BL03菌種無菌接種于MRS液體培養基中,37 ℃恒溫培養OD600至3.0～5.0, 然后按5%(體積分數)接種于MRS液體培養基中,37 ℃恒溫培養24 h,反復活化2～3次。

1.3.2 純菌泥的制取

經擴大培養的乳雙歧桿菌BL03,OD600在8.0～10.0,低溫高速離心機離心15 min(8 000 r/min,10 ℃),棄上清液, 收集菌泥至三角燒瓶中,4 ℃冰箱中保存。

1.3.3 靜電噴霧干燥

靜電噴霧是通過在較低溫度(室溫至90 ℃)的惰性環境中(氧氣體積分數<5%)產生靜電霧化,先將乳化液進行靜電離子化處理,靜電效應將極性水分子和極性溶劑排斥到外表面,非極性的活性物質和賦形劑聚集在核心內部,再在較低溫度下進行水分和溶劑蒸發干燥,從而形成微囊。

保護劑優化：制備微生物膠囊通常可采用海藻酸鹽作為成膜材料[14-15],海藻糖、亞麻酸、CaHPO4、β-環糊精、阿拉伯膠也是常用的保護劑成分。分別將不同質量分數的上述物質加入到5%的麥芽糊精乳液中開展保護劑單因素試驗,純菌泥與保護劑以一定比例[m(菌泥)∶m(保護劑)=1∶2]進行乳化保護。選取保護效果較好的4種保護劑進行4因素3水平正交試驗設計,得到靜電噴霧干燥復配保護劑。噴霧條件為：氣體流速30 Nm3/h,進風溫度80 ℃,物料泵流量30 r/min,靜電壓20 kV,霧化壓力為220 kPa。

噴霧參數優化：選取噴霧干燥可變參數進風溫度、物料泵流量、靜電壓為工藝參數,以存活率為響應因子,設計3因素3水平正交試驗。

1.3.4 常規噴霧干燥

選取脫脂乳粉、麥芽糊精、阿拉伯膠為保護劑,純菌泥與保護劑以一定比例[m(菌泥)∶m(保護劑)=1∶2]進行乳化保護,噴霧干燥條件為,進風溫度130 ℃,物料泵流量45 r/min。

1.3.5 乳化冷凍干燥

選取脫脂乳粉、海藻糖、海藻酸鈉為保護劑,純菌泥與保護劑以一定比例[m(菌泥)∶m(保護劑)=1∶2]進行乳化保護,1 000 r/min乳化10 min,低溫真空冷凍干燥,凍干條件：-50 ℃預冷凍2 h,逐步升溫至-18 ℃,干燥24 h,再升溫至28 ℃,干燥4 h,周期48 h。

1.3.6 模擬胃液實驗

向MRS培養基中加入質量分數0.5%的胃蛋白酶,調pH值至2.0,用0.22 μm的微孔濾膜過濾備用,分別接種優化后的乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥菌粉、常規噴霧干燥菌粉和乳化凍干菌粉,37 ℃厭氧條件下作用0、1、2 h后取樣測定活菌數,計算存活率[16]。

1.3.7 模擬腸液實驗

向MRS培養基中加入質量分數1.0%的胰蛋白酶和0.3%的膽鹽,調pH值至6.5,用0.22 μm的微孔濾膜過濾備用,分別接種優化后的乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥菌粉、常規噴霧干燥菌粉和乳化凍干菌粉,37 ℃厭氧條件下作用0、1、2、3、4 h后取樣測定活菌數,計算存活率[16]。

1.3.8 溫度穩定性試驗

將優化后的乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥菌粉、常規噴霧干燥菌粉和乳化凍干菌粉置于4、25 ℃恒溫恒濕生化培養箱中,控制相對濕度為65%,測定0、1、3、6、9、12月活菌數,計算存活率。

1.3.9 微膠囊包埋率的測定

分別取1 g優化后的乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥菌粉、常規噴霧干燥菌粉和乳化凍干菌粉,加入9 mL pH 7.4的解囊液中,37 ℃振蕩完全崩解后,用無菌生理鹽水進行梯度稀釋,稀釋至活菌數在30～300 CFU/mL。分別取0.1 mL 3個梯度稀釋的菌懸液滴于平板上,傾注MRS液體培養基,緩慢混合均勻,倒置在 37 ℃恒溫條件下培養72 h,觀察菌落生長情況并計數[17]。

分別取1 g優化后的乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥菌粉、常規噴霧干燥菌粉和乳化凍干菌粉,加入9 mL稀釋液中,37 ℃振蕩完全稀釋后,用無菌生理鹽水進行梯度稀釋計數，按公式(1)計算包埋率：

(1)

式中：C1,稀釋液中的活菌數,CFU/g；C0,解囊液中的活菌數,CFU/g。

1.3.10 掃描電鏡觀察微膠囊益生菌

參考MARESCA等[18]方法,將優化后的乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥菌粉、常規噴霧干燥菌粉和乳化凍干菌粉分別置于Smart Coater儀器中涂膜2 min,再用JCM-7000臺式掃描電子顯微鏡觀察100、12 000倍的掃描圖像,加速電壓15 kV。

2 結果與分析

2.1 保護劑對乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥微囊化活菌數的影響

2.1.1 單一保護劑對靜電噴霧干燥微囊化乳雙歧桿菌BL03活菌數的影響

分別將不同質量分數的海藻酸鈉、海藻糖、亞麻酸、CaHPO4、β-環糊精和阿拉伯膠加入到5%質量分數的麥芽糊精溶液中進行單因素試驗,由圖1可知,海藻糖為14%、亞麻酸為8%、CaHPO4和β-環糊精為11%時靜電噴霧干燥的乳雙歧桿菌BL03的存活率最高,并且隨著海藻糖、β-環糊精、亞麻酸和CaHPO4含量的增加其存活率反而下降。海藻糖在干燥過程中會形成玻璃態,且黏度很大,質量分數高于14%時黏度過高反而會影響分子擴散能力。β-環糊精為環狀低聚糖,具有成膜性,當質量分數超過11%時會抑制極性物質遷移。

B1-海藻酸鈉;B2-海藻糖;B3-亞麻酸;B4-CaHPO4;B5-β-環糊精;B6-阿拉伯膠圖1 單因素保護劑對靜電噴霧干燥乳雙歧桿菌BL03存活率的影響Fig.1 Effects of single protectants on survival rate of electrostatic spray drying B.lactis BL03

CaHPO4中的Ca2+在靜電效應下能加快體系中極性分子的遷移和干燥,但當陽離子數量顯著高于陰離子數量,離子間作用力破環,微膠囊化效果不理想[19]。當體系中添加一定量的亞麻酸時,有助于形成W/O 的乳濁液體系,為雙歧桿菌提供厭氧的環境。

2.1.2 復合保護劑對靜電噴霧干燥微囊化乳雙歧桿菌BL03活菌數的影響

復合保護劑中的各成分在干燥中均發揮著各自的作用,同時相互間又具有協同作用,只有在比例及含量達到協調時,才能達到最佳的保護效果[20]。選取海藻糖、β-環糊精、亞麻酸和CaHPO4進行4因素3水平正交試驗,設計復合保護劑正交試驗如表1所示。由表2 可知,實驗組6的乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥微囊化菌粉存活率最高,A2B3C1D2組合存活率高達86.37%,各組分質量分數分別為海藻糖14%,亞麻酸10%,CaHPO46%,β-環糊精11%。通過均值和極差分析,4種保護劑的保護效果依次是海藻糖>β-環糊精>CaHPO4>亞麻酸。優化后的保護劑能顯著提高乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥微囊化的存活率。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 復合保護劑對靜電噴霧干燥乳雙歧桿菌BL03存活率的影響Table 2 Effects of compound protectants on survival rate of electrostatic spray drying B.lactis BL03

2.2 靜電噴霧干燥工藝對乳雙歧桿菌BL03存活率的影響

選取進風溫度、物料泵流量、靜電壓設計3因素3水平正交實驗。如表3所示,復合保護劑6為乳化保護劑,考察乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧微囊化后的存活率,結果如表4所示。

表3 正交實驗因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal test

表4 靜電噴霧干燥工藝對乳雙歧桿菌BL03存活率的影響Table 4 Effects of electrostatic spray drying on survival rate of B.lactis BL03

由表4可知,實驗組5的乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥微囊化活菌數存活率最高,A2B2C3組合時乳雙歧桿菌BL03存活率高達89.26%,即進風溫度80 ℃,物料泵流量30 r/min,靜電壓25 kV。通過均值和極差分析,3種工藝參數對活菌數存活率影響大小依次是進風溫度>物料泵流量>靜電壓。噴霧干燥過程中高溫會對菌體結構如細胞膜、核糖體、核酸、蛋白質等造成破壞,致使細胞死亡,通過加大噴霧干燥物料流量,可使單位量的物料受熱減少,降低菌體的損傷[21]。

2.3 模擬胃液、腸液對不同微囊化乳雙歧桿菌BL03存活率的影響

分別將靜電噴霧干燥、常規噴霧干燥和乳化干燥乳雙歧桿菌BL03菌粉在模擬胃液環境下處理0、1、2 h,其存活率如圖2所示。靜電噴霧干燥微囊化乳雙歧桿菌BL03具有較強的耐受胃液能力,作用2 h的存活率超過80%,優于常規噴霧干燥和乳化干燥,可能與微囊化包埋效果相關。

圖2 不同微囊化乳雙歧桿菌BL03在模擬胃液中的存活率Fig.2 Survival rates of different microencapsulated B.lactis BL03 at simulated gastric fluid

分別將靜電噴霧干燥、常規噴霧干燥和乳化干燥乳雙歧桿菌BL03菌粉在模擬腸液環境下處理0、1、2、3、4 h,其存活率如圖3所示。靜電噴霧干燥微囊化乳雙歧桿菌BL03具有較強的耐受腸液能力,作用4 h的存活率達75%,明顯優于常規噴霧干燥和乳化干燥,可能與微囊化包埋效果相關。

圖3 不同微囊化乳雙歧桿菌BL03在模擬腸液中的存活率Fig.3 Survival rates of different microencapsulated B.lactis BL03 at simulated intestinal fluid

葉賢江等[22]研究了雙歧桿菌混凝膠微膠囊制備和經人工模擬腸胃環境處理后,活菌數均保持原來的數量級,平均存活率為49.8%,遠高于對照菌懸液(0.13%),與SHU等[23]研究的微膠囊化兩歧雙歧桿菌BB01研究結果相符,也與本研究中乳化干燥菌粉研究結果相符,均明顯低于靜電噴霧干燥微囊化菌粉存活率。

2.4 儲存溫度對不同微囊化乳雙歧桿菌BL03穩定性的影響

分別將靜電噴霧干燥、常規噴霧干燥和乳化干燥乳雙歧桿菌BL03在4 ℃恒溫恒濕環境下處理1、3、6、9、12個月,其存活率如圖4所示。靜電噴霧干燥微囊化乳雙歧桿菌BL03在4 ℃下的穩定性優于常規噴霧干燥和乳化干燥,但穩定性差異不大。

圖4 不同微囊化乳雙歧桿菌BL03在4 ℃的穩定性Fig.4 Stability of different microencapsulated B.lactis BL03 at 4 ℃

分別將靜電噴霧干燥、常規噴霧干燥和乳化干燥乳雙歧桿菌BL03在25 ℃恒溫恒濕環境下處理1、3、6、9、12個月,其存活率如圖5所示。靜電噴霧干燥微囊化乳雙歧桿菌BL03在25 ℃下12個月存活率超過70%,明顯優于乳化干燥的40%,而與常規噴霧干燥的穩定性差異不大,可能與微囊化包埋效果有關,另外可能與噴霧干燥處理工藝有關。

圖5 不同微囊化乳雙歧桿菌BL03在25 ℃的穩定性Fig.5 Stability of different microencapsulated B.lactis BL03 at 25 ℃

2.5 不同微囊化乳雙歧桿菌BL03的包埋率

分別將乳雙歧桿菌BL03在靜電噴霧干燥、常規噴霧干燥和乳化干燥下進行微囊化處理,微囊化包埋率如圖6所示。靜電噴霧干燥微囊化包埋率高達93.3%,明顯高于乳化干燥的57.5%,高于HOLKEM等[24]制備的雙歧桿菌BB-12凍干微膠囊的包埋效率(89.71%)。說明靜電噴霧干燥微囊化包埋效果很好。

圖6 不同微囊化乳雙歧桿菌BL03的包埋率Fig.6 Embedding rates of different microencapsulated B.lactis BL03

2.6 不同微囊化方法乳雙歧桿菌BL03電鏡圖片分析

觀察乳雙歧桿菌BL03在100、12 000倍下的靜電噴霧干燥菌粉、常規噴霧干燥菌粉和冷凍干燥菌粉。從乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥菌粉100倍掃描電鏡圖像(圖7-a)可知,分布有大量較規則球狀顆粒,且大部分顆粒簇擁成團,說明微囊化包埋率較好,單個細菌細胞包埋程度好,因為成團簇擁,推測菌粉溶解性好。圖7-b是乳雙歧桿菌BL03常規噴霧干燥菌粉100倍掃描電鏡圖像,大小不一,球狀形態,球體直徑相差較大,說明常規噴霧干燥微囊化包埋效果不均一,大量菌體成團后才形成微囊化,影響單個菌體細胞包埋效率。圖7-c是乳雙歧桿菌BL03乳化冷凍干燥菌粉100倍掃描電鏡圖像,成不規則碎石狀,大小不一,部分粘連,單個菌體細胞包埋效果不佳。

a-靜電噴霧干燥組;b-常規噴霧干燥組;c-乳化冷凍干燥組圖7 三種干燥方式下乳雙歧桿菌BL03的掃描電鏡圖像(×100)Fig.7 SEM images of electrostatic spray drying, traditional spray drying and freeze drying B.lactis BL03

從乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥菌粉12 000倍掃描電鏡圖像(圖8-a)可知,微囊化球體表面光滑,成膜性良好,無明顯裂縫,密封性好,推測單個菌體細胞微囊化保護效果很好,抗逆性環境干擾能力強。另外,推測球體凸起部分是雙歧桿菌菌體形狀。圖8-b是乳雙歧桿菌BL03常規噴霧干燥菌粉12 000倍掃描電鏡圖像,成褶皺球形,表面凹凸不平,因為常規噴霧干燥是微囊化表層水分蒸發后,內部水分遷移至外層,導致內部結構塌陷,影響菌體微囊化保護效果。另外,從電鏡圖像(圖8-b)大小可推測多個菌體細胞成團后才形成微囊化包埋。圖8-c是乳雙歧桿菌BL03乳化冷凍干燥菌粉12 000倍掃描電鏡圖像,微囊化菌體表層有大量裂痕,不光滑,密封性不佳,菌體微囊化保護效果差,逆性環境抵抗能力差。在冷凍干燥過程中,水由冰晶直接升華而失去水分,菌劑微觀結構呈現塊狀并有許多孔洞[25]。另外,從電鏡圖像(圖8-c)可觀察到大量水珠狀球體,從大小推測可能是乳雙歧桿菌菌體細胞,因此,其微囊化包埋效果較差。

a-靜電噴霧干燥組；b-常規噴霧干燥組；c-乳化冷凍干燥組圖8 乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥、常規噴霧干燥和乳化冷凍干燥掃描電鏡圖像(×12 000)Fig.8 SEM images of electrostatic spray drying, traditional spray drying and freeze drying B.lactis BL03

通過乳雙歧桿菌BL03靜電噴霧干燥菌粉、常規噴霧干燥菌粉和乳化冷凍干燥菌粉掃描電鏡圖像分析,其微囊化掃描電鏡結構差異顯著,進一步證明了不同微囊化菌粉的抗逆性能力和包埋率差異。靜電噴霧干燥菌粉外表面未出現裂紋,這對保護微球內部菌體免受高溫損傷及防止存儲過程中細胞膜脂質的過氧化有重要作用。

3 總結

靜電噴霧干燥是活性物質包埋保護的新型微囊化技術,由于益生菌自身的特性,大部分益生菌的活性會受制備過程、儲存過程和人體胃腸道環境影響,導致益生菌功能表達降低。本文首次研究了靜電噴霧干燥乳雙歧桿菌BL03微囊化保護劑,通過單因素和正交試驗,最優保護劑各組分質量分數分別為海藻糖14%,亞麻酸10%,CaHPO46%,β-環糊精11%,靜電噴霧微囊化乳雙歧桿菌BL03存活率高達86.37%。在最優保護劑基礎上,通過正交試驗優化最佳靜電噴霧微囊化工藝進風溫度80 ℃,物料泵流量30 r/min,靜電壓25 kV,存活率高達89.26%。

首次研究比較了靜電噴霧干燥、常規噴霧干燥和乳化冷凍干燥3種不同微囊化方法包埋乳雙歧桿菌BL03的效果。靜電噴霧干燥乳雙歧桿菌BL03在模擬胃液、腸液和儲存溫度耐受下的活菌數存活率均高于常規噴霧干燥和乳化冷凍干燥,模擬胃液作用2 h存活率超過80%,模擬腸液作用4 h的存活率達到75%,25 ℃下12個月存活率超過70%,平均提高了45%～75%左右。優化保護劑和工藝后的靜電噴霧干燥乳雙歧桿菌BL03包埋率高達93.3%,明顯高于乳化干燥微囊化方法包埋率57.5%。首次通過掃描電鏡圖像分析,乳雙歧桿菌BL03菌粉的靜電噴霧干燥微囊化包埋效果明顯優于常規噴霧干燥和乳化冷凍干燥,同時,進一步證明了不同微囊化方法包埋乳雙歧桿菌BL03菌粉抗逆性等性能。該研究說明新型靜電噴霧干燥微囊化方法適合包埋乳雙歧桿菌。