海參酶解物促SD大鼠皮膚創面愈合效果的研究

程敏君,胡錦華,唐雪,楊亭亭,周鵬*,胡煒

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122) 3(山東好當家海洋發展股份有限公司,山東 威海,264200)

海參是藥食同源的珍貴補品,具有高蛋白、低脂肪和低糖的特點[1]。受氣候環境的影響,成熟海參的個體差異較大,較小個體的海參只能作為低值產品出售。隨著海參逐年上升的消費趨勢和日益擴大的養殖規模[2],小個體海參的高值化利用問題亟待解決。海參的個體大小與營養組成相關性不大[3],因此利用小個體海參開發保健食品或藥品是其高值化利用的有效途徑之一,如開發具備抗炎癥[4]、抗凝血[5]、抗真菌[6]和增強機體免疫功能[7]等功效的口服液、功能飲料和膠囊等。

目前,關于海參促傷口愈合的研究十分有限。事實上,機體在創面愈合過程中需要大量的營養底物提供創面處細胞的合成和能量需求[8]。海參不僅富含膠原蛋白,還富含具有調節機體炎癥反應[9]和免疫修復作用[10]的精氨酸、支鏈氨基酸以及各種微量元素,具有良好的促傷口愈合的潛力。但海參蛋白存在溶解性不佳和消化吸收性較差等問題。

本研究以小個體海參為原料,通過酶解獲得較小的分子質量、易吸收的海參酶解物(sea cucumber hydrolysate,SCH),再開展動物實驗對其進行功效驗證,探究SCH對創面愈合的影響,以期為海參資源的綜合高價值利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參,無錫天鵬海鮮市場；SD大鼠(SPF級、5周齡雄性),維通利華實驗動物有限公司；風味蛋白酶(30 000 U/g)、水產蛋白酶(300 000 U/g),東恒華道生物科技有限責任公司；云南白藥顆粒,云南白藥集團股份有限公司；硫酸慶大霉素,敖東藥業集團延吉股份有限公司；大鼠白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的Elisa試劑盒,上海酶聯生物科技有限公司；其他實驗試劑均為分析純,上海生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

料理機(AD-G888),德國GUGE公司；凱氏定氮儀(SKD-200),上海沛歐分析儀器有限公司；高效液相色譜儀(Agilent 1260),美國Agilent公司；冷凍離心機(Heraeus X1R)、酶標儀(Multiskan Sky),美國Thermo Scientific 公司；冷凍干燥機(BTP),美國SP Scientific公司；一次性活檢打孔器(D=10 mm),圣諾圖穿刺器材公司；等距平衡光拍攝支架,芯鮮數碼公司；佳能單反相機(EOS 80D),日本Canon公司；生物顯微鏡(DM 2000),德國Leica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 海參營養組成中有機物含量和氨基酸分析

參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》的凱氏定氮法測定粗蛋白含量；參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》的酸水解法測定粗脂肪含量；參考宋思暖等[11]方法提取海參粗多糖,并用苯酚-硫酸法[12]測定其含量；參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》中酸水解法測定16種常見氨基酸的組成；參考DB 37/T 2094—2012《水產品中羥脯氨酸含量的測定 高效液相色譜法》測定羥脯氨酸的含量。

1.3.2 SCH制備

將鮮參洗凈棄內臟,剪碎勻漿。勻漿物置于無菌發酵罐中,料液比為1∶4(g∶mL),加酶量10 000 U/g(水產蛋白酶和風味蛋白酶按照4∶6的酶活力比例混合形成復合酶),溫度52 ℃。酶解1 h后滅酶并冷卻,加入乙醇除雜[13],低溫離心,保留上清液進行旋蒸濃縮和冷凍干燥,獲得SCH備用。

1.3.3 SCH的分子質量分布測定

采用高效液相色譜法測定樣品的分子質量分布情況,設定參數如下：色譜柱;TSK GEL 2000 SWXL (300 mm×7.8 mm)；流動相,V(含體積分數0.1%三氯乙酸的乙腈)∶V(超純水)=40∶60；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；體積10 μL；樣品質量濃度1 mg/mL；分析配件,2487紫外檢測器和GPC分析軟件。以標準品細胞色素C(Mw=12 384 Da)、抑肽酶(Mw=6 500 Da)、桿菌酶(Mw=1 422 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw=451 Da)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mw=189 Da)為對照。

1.3.4 動物實驗分組及處理

1.3.4.1 動物實驗分組

SD雄鼠90只,分為5組(n=18),包括模型組(Vehicle)、SCH低劑量(L-SCH)、中劑量(M-SCH)、高劑量(H-SCH)組和陽性組(云南白藥顆粒,YNBY)[14]。將SCH用生理鹽水復溶,其中低、中、高劑量按照0.25、0.50和1.00 g/kg的蛋白含量進行配制[15],過0.22 μm膜,現配現用。根據云南白藥膠囊說明書推薦劑量和動物藥理試驗換算法則[16],陽性組的灌胃劑量為0.10 g/kg。以上5組每天的灌胃體積均為0.01 mL/g,模型組灌胃生理鹽水,飼養期間對大鼠體重進行記錄并觀察健康狀況。

1.3.4.2 全皮層切除模型的建立

檢疫期結束后適應性灌胃5～7 d。大鼠造模前禁食16 h,按35 mg/kg的注射劑量腹腔注射質量分數為1%的戊巴比妥鈉進行麻醉。除去大鼠背部毛發,用醫用酒精消毒,在脊柱中部兩側的相同位置,用活檢打孔器制作圓形傷口,制備全皮層切除傷口并視為第0天。術后,所有大鼠均接受10 000單位的硫酸慶大霉素腹腔注射避免感染,同時用拍照裝置拍攝創面記錄。造模后第1天起,每日對大鼠進行灌胃,于第4天、第8天和第12天分批取樣(n=6)[16]。取樣前進行創面拍攝,心臟取血,切取兩側新生傷口組織置于液氮中,結束取樣后存于-80 ℃冰箱中備用。本次動物實驗的倫理申請經過江南大學動物倫理委員會認可,審核編號為JN.No20191015S1051122。

1.3.5 傷口愈合率測定方法

采用等距平衡光拍攝裝置對創面進行拍照,并用直角尺對照記錄。用Adobe Photoshop 2020和 Image-Pro Plus 6.0軟件計算大鼠創面面積來計算愈合率,按公式(1)計算傷口愈合率[18]：

(1)

式中：S0,原始傷口面積,cm2；S,現存傷口面積,cm2。

1.3.6 組織切片染色分析

蘇木精伊紅染色(hematoxylin-eosin,H&E)和馬森三色染色(Masson’s trichrome method,Masson)是組織病理學常用的分析方法,常用來觀察皮膚中成纖維細胞增值、血管新生和膠原纖維排列等情況[19]。將皮膚組織用體積分數為4%的中性甲醛現配液固定,石蠟包埋并切片,分別進行H&E和Masson染色,在生物顯微鏡下觀察并記錄皮膚傷口的病理變化和纖維新生情況。

1.3.7 血液中炎癥因子的Elisa分析

取待測血清在冰浴中解凍,根據Elisa試劑盒使用說明書進行樣本預處理并測定IL-8和IL-10的含量。

1.3.8 組織中羥脯氨酸和生長因子的Elisa分析

取待測組織在冰浴中解凍,根據Elisa試劑盒使用說明書進行樣本預處理,測定和計算Hyp、EGF、VEGF和bFGF的含量。

1.4 數據處理

采用SPSS 20軟件里One-Way ANOVA方法下的LSD和Ducan’s multiple range test方法對試驗數據進行分析,用不同的字母表示組間存在顯著差異(P<0.05)；用Origin 2017軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 海參的營養組成

海參營養組成中的有機物主要是蛋白質、粗脂肪和粗多糖。通過實驗測得,海參干基中蛋白質占比為(49.57±0.92)%,粗脂肪為(5.16±0.26)%,粗多糖為(4.02±0.24)%,可見海參營養物質中最主要的有機物為蛋白質,約占總有機物的85.00%,該結果與高菲[20]測得的結果相似,故海參是一種富含蛋白質的優質海產品。

海參的氨基酸組成及其含量如表1所示,海參中氨基酸含量較高的依次為谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、羥脯氨酸(Hyp)和丙氨酸(Ala),這7種氨基酸可占總量的66.50%。其中,Pro和Hyp總占比可達14.80%,是膠原蛋白重要組成的氨基酸,且有文獻報道膠原蛋白是皮膚的重要組成基質[21]。此外,Arg是條件必需氨基酸,含量為6.70%,具有調節創面愈合作用[9]；纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)是支鏈氨基酸,總含量約為15.00%,具備免疫調節和機體修復的生理功能[10]。故海參富含多種與創面修復相關的營養物質,是一種潛在的具有促創面愈合功效的食品。

表1 海參的氨基酸組成Table 1 Amino acid compositions of sea cucumber

2.2 SCH的分子質量分布

SCH的分子質量分布結果如圖1所示, SCH的分子質量<2 000 Da約占97.41%,其中<1 000 Da占88.70%,180～500 Da占50.80%,<180 Da占19.93%。已有研究報道,2～3個氨基酸組成的小肽吸收效率最高且生理活性最強,可通過PepT1被小腸黏膜直接吸收利用[22]。由圖1可知,經酶解后的樣品中180～500 Da的肽段含量最高,這其中主要為二肽和三肽[23]。因此,與未酶解的海參大分子蛋白相比,SCH更易被人體消化吸收和發揮生理功效。

圖1 SCH的分子質量分布圖Fig.1 Molecular mass distribution of SCH

2.3 SCH對SD大鼠體重的影響

通過監測各組大鼠的體重變化,考察灌胃SCH的安全性。由圖2可知,飼養期間各組大鼠均在自由生長,各組間體重沒有顯著差異(P>0.05)。同時觀察到大鼠的攝食頻率、糞便情況和毛發狀態等,均無異常,表明SCH對大鼠的正常生長沒有副影響。

圖2 各組大鼠的體重變化曲線Fig.2 Body mass changing curves of rats in each group

2.4 傷口愈合率

通過監測大鼠創面愈合率分析SCH促創面愈合的效果。由圖3-a可知,大鼠皮膚創面隨著時間的延長逐漸愈合,第4天創面均已結痂,在第12天時,肉眼可見SCH各組和陽性組的傷口面積均小于模型組,且部分出現了粉嫩的新生組織,尤以中劑量組最為顯著。結合圖3-b所示,第4天的SCH各組和陽性組愈合率均超過模型組,但不存在顯著性(P>0.05)；第8天中劑量組顯著高于模型組(P<0.05)；第12天低劑量組、中劑量組和陽性組顯著高于模型組(P<0.05)。說明SCH可促進創面愈合,且愈合速度與云南白藥組無顯著差異,尤其以中劑量組表現效果最佳。

a-各時間段代表性圖片；b-傷口愈合率圖3 SCH對大鼠創面愈合的影響Fig.3 Effect of SCH on wound healing in rats注:不同字母表示組間有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.5 H&E染色病理分析

創面處炎性細胞狀態、成纖維細胞增殖、血管新生和再上皮化等狀況[19]可以用H&E染色結果顯示,其結果如圖4所示。

第4天模型組表現出炎性細胞浸潤的特點,而SCH各組和陽性組的炎性細胞較少,且有大量血管新生；第8天,各組創面均上皮化,其中模型組仍有大量炎性細胞,而SCH各組和陽性組有少量毛囊和皮膚附屬器生成；第12天,SCH各組和陽性組均有大量皮膚附屬器和毛囊形成,而模型組中較少。其中,中劑量組的膠原纖維和皮膚附屬器排列緊密有序,新生表皮較薄,重塑效果優于云南白藥組。說明SCH可以調節創面處炎性細胞浸潤程度,促進血管新生、成纖維細胞增殖和再上皮化。

C-炎性細胞；B-血管；F-成纖維細胞；E-表皮；G-皮膚附屬器；H-毛囊圖4 第4、8、12天創面處H&E染色的代表性顯微鏡圖片(×100)Fig.4 Representative micrographs of H&E-stained section of wounds on day 4, 8 and 12圖中“—”表示100 μm(圖6同)

2.6 血清中炎癥因子水平

通過測定大鼠血清中炎癥因子的分泌量來表征機體的炎癥現象,其中IL-8可以通過促進炎性細胞浸潤[24]而延長炎癥反應,相反的,IL-10有抗炎功能[25]。如圖5所示,不同時期內SCH組的IL-8含量均顯著低于模型組(P<0.05),IL-10含量顯著高于模型組(P<0.05),且存在劑量依賴性,這與圖4中各組的炎癥細胞浸潤結果一致。說明SCH可以調節大鼠機體的炎癥反應,從而影響創面愈合速度。

圖5 SCH對大鼠血清中炎癥因子的影響Fig.5 Effect of SCH on the inflammatory factors of serum from rats

2.7 創面膠原纖維新生情況

膠原纖維的新生是創面愈合所必須的,而Masson染色法可以將膠原纖維染成藍紫色[19],所以對比藍紫色的密度和深度可以判斷各時間段創面處膠原纖維的含量。如圖6所示,隨著時間的增加,藍色區域面積和密度越來越多,說明創面處新生了大量膠原纖維。第4天,SCH中、高劑量組和陽性組中藍色較模型組多；第8天,SCH各組和陽性組的膠原纖維含量明顯多于模型組；第12天,SCH各組和陽性組的膠原纖維大量合成,且對比3個SCH劑量組可知膠原纖維合成具有劑量依賴性,此外,SCH中劑量組表現出有序的膠原纖維排列,甚至優于高劑量組和陽性組。

圖6 第4、8、12天創面處Masson染色的代表性顯微鏡圖片(×100)Fig.6 Representative micrographs of Masson-stained section of wounds on day 4, 8 and 12

2.8 創面羥脯氨酸水平

Hyp是膠原蛋白的特征氨基酸[21],其含量可用于分析皮膚中膠原蛋白含量。由圖7可知,在第4天,SCH各組的Hyp水平已經顯著高于模型組(P<0.05),第8天和第12天也出現類似趨勢,且存在劑量依賴性。此外,圖7的結果和圖6的結果顯示相似的趨勢,表明SCH可以促進創面處Hyp合成分泌,促進膠原形成。

圖7 SCH對大鼠創面中羥脯氨酸含量的影響Fig.7 Effect of SCH on the hydroxyproline content in wound of rats

2.9 組織中生長因子水平

為探討SCH對創面愈合的作用機制,從而測定了創面處生長因子VEGF、bFGF和EGF的水平。由圖8可知：3個SCH劑量組中VEGF含量在3個時間點的表達水平均顯著高于模型組(P<0.05)；在第4天和第8天,3組SCH的EGF和bFGF的分泌量顯著高于模型組(P<0.05),其中SCH中、高劑量組在第12天的含量繼續顯著高于模型組(P<0.05)。此外,對比SCH中、高劑量組的數據發現,除了第8天的EGF表達水平存在差異外,其余生長因子在3個時間段的表達水平不存在顯著性(P>0.05)。以上數據表明,在創面愈合過程中,SCH可以上調創面處生長因子VEGF、bFEF和EGF的表達水平,且SCH中劑量組就可以達到與高劑量組相似的效果。

圖8 SCH對大鼠創面中生長因子含量的影響Fig.8 Effect of SCH on growth factors content in wound of rats

3 討論

皮膚的傷口愈合是一個繁雜的動態過程,需要多種組織和細胞因子協同完成,此外還需要營養底物供給來促進蛋白的合成。有文獻報道,羥脯氨酸、脯氨酸和精氨酸可以促進膠原合成[26],支鏈氨基酸可以促進蛋白合成和機體修復[27],小分子寡肽可以調節機體炎癥反應和促進生長因子分泌[28]。本研究證實SCH是一種富含蛋白質的產品,同時含有豐富的羥脯氨酸、精氨酸、脯氨酸、支鏈氨基酸和小分子寡肽,從理論上提示SCH可提供創面愈合的營養需求,可作進一步的功效驗證探索。

云南白藥是我國治療外傷的常用藥,據文獻報道,云南白藥可抑制炎癥、加速創面凝血,還可以促進生長因子分泌加速肉芽形成和組織重塑[29]。本研究選用云南白藥作為陽性對照,通過動物實驗對SCH的促傷口愈合功效進行驗證。創面愈合會經歷4個階段,主要涉及炎性細胞浸潤、炎癥因子釋放、成纖維細胞增殖、膠原沉積、肉芽組織形成和創面上皮化這幾個過程[30]。本研究中H&E染色和血清中IL-8、IL-10水平的結果顯示,SCH可同時上調IL-10和下調IL-8的含量,以減少創面處炎性細胞的浸潤。李林等[15]發現,海參膠原低聚肽可以通過調節IL-8和IL-10的分泌來減緩機體的炎癥反應,這與本研究的結果一致。同時有研究表明,炎癥反應主要出現在愈合前中期,且適當的炎癥反應是有利于創面愈合的,因為很多生長因子來源于炎性細胞,但是過度的炎癥反應會延緩傷口愈合[31]。故對比3個劑量組和陽性組的抗炎效果,結果顯示均減緩了炎癥反應,但高劑量組的抗炎性過于激烈,甚至超過陽性組,而中劑量組顯示適中的抗炎性。此外H&E染色結果還顯示,中劑量組在愈合后期的重塑效果優于高劑量組和陽性組,這可能與炎癥的適度調節有關。膠原是細胞外基質的重要組分,而羥脯氨酸是膠原的特有氨基酸。WANG等[32]證實了來源于鮭魚皮的膠原肽通過促進膠原沉積加快剖宮產大鼠的傷口愈合。本研究中檢測了創面處的Hyp水平,結果可知SCH可促進膠原沉積,這可能與SCH原料中富含膠原肽有關。同時有文獻報道,在傷口愈合后期,過多的膠原沉積會造成增生性疤痕的形成[33]。本研究中Masson染色結果可見,在愈合后期,高劑量組的新生表皮較厚,而中劑量組的新生表皮薄且皮膚附屬器排列有序,說明高劑量組可能存在膠原沉積過度的現象,而中劑量組的膠原合成分泌量更適宜。此外,生長因子的調控是創面愈合中至關重要的,其各自發揮著不同的作用。VEGF是一種特異性作用于血管內皮細胞的生長因子,具有促進血管內皮細胞增殖和血管生成的作用[34]。EGF是促進細胞分裂的因子,可促進多種細胞分裂并形成肉芽組織,同時增加肉芽組織中膠原合成,對皮膚損傷有較好的促愈合作用[35]。bFGF是一種堿性多肽,可以刺激膠原蛋白表達和細胞增殖,從而促進損傷修復[36]。本研究顯示,3個劑量組的SCH均可上調創面處VEGF、bFGF和EGF的表達,促進肉芽組織的成熟和再上皮化,從而促進創面愈合。同時對比3個劑量組促生長因子分泌的情況可知,SCH中劑量組可以獲得與高劑量組相似的效果。

4 結論

綜上所述,本研究制備的SCH具有促SD大鼠創面愈合的功效。此外,無論在調節炎癥反應還是促膠原合成的作用上,SCH中劑量組均表現出最適性,同時在刺激生長因子分泌的效果上,SCH中劑量組已經達到與高劑量組相同的作用,故在促創面愈合功效上,SCH中劑量組(0.50 g/kg)表現最優,這為今后企業的功能食品開發提供數據支撐。對于SCH促創面愈合機制的探索發現,SCH通過調節創面處生長因子的分泌量來促進傷口愈合,這可能與生長因子VEGF、bFGF和EGF的表達水平上調有關,因此可以為進一步研究SCH促創面愈合的機制提供思路和依據。