賀蘭山東麓不同子產區赤霞珠葡萄自然發酵對葡萄酒香氣的影響

金剛,張雪,谷曉博,王輝,白雪菲,張眾,蓋昱梓,馬雯*

1(寧夏大學 農學院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川,750021) 3(葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,寧夏 銀川,750021)4(寧夏葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,寧夏 銀川,750021)

葡萄酒的發酵主要包括兩個階段：由酵母參與的酒精發酵階段和由乳酸菌參與的蘋果酸-乳酸發酵階段。在自然的條件下,即使不接種酵母和乳酸菌,葡萄上的野生酵母和乳酸菌也能啟動和完成酒精發酵和蘋乳發酵。自然酒精發酵主要是非釀酒酵母和釀酒酵母將葡萄中的糖轉化為酒精并產生酯類、高級醇和醛類等風味物質的生物化學過程[1],接種酒精發酵則主要是由釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)完成這一轉化過程的,酒精發酵能夠產生大量復雜的香氣物質,尤其對果香型葡萄酒的質量有重要影響,也給陳釀型葡萄酒提供大量的香氣前體物質。自然蘋乳發酵是酒精發酵結束后,在多種乳酸細菌的作用下將L-蘋果酸轉化為L-乳酸,產生雙乙酰、乙偶姻等多種風味物質的過程,接種蘋乳發酵則主要由酒酒球菌(Oenococcusoeni)完成這一過程的。蘋乳發酵能夠改善葡萄酒的口感和香氣,使葡萄酒變得更加圓潤飽滿,提升葡萄酒的感官品質[2]。

寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區憑借其獨特的地理優勢,被業界公認為生產優質釀酒葡萄和葡萄酒的黃金地帶。赤霞珠(VitisviniferaL.Cabernet Sauvignon)是目前寧夏賀蘭山東麓產區的主栽品種,該品種釀制的葡萄酒具有口感醇厚、香氣濃郁的特點。然而,目前產區的葡萄酒釀造多依賴進口的商業菌株,商業菌株的廣泛使用使得葡萄酒的同質化問題愈加嚴重,不利于本土特色葡萄酒的發展。賀蘭山東麓產區多樣化的葡萄種植區域蘊藏了豐富的釀酒微生物資源,這些野生的釀酒微生物在一定程度上有助于賀蘭山東麓葡萄酒特色和風格的體現。有一些研究表明,自然發酵或使用分離于葡萄漿果、葡萄園和地窖的非釀酒酵母等本土菌株與釀酒酵母進行混合發酵，在復雜性和感官豐富度上對葡萄酒的感官輪廓發揮著至關重要的作用,有助于改善葡萄酒的香氣、酒體,保護特定產區葡萄酒的感官典型性[3-5]。

本研究以賀蘭山東麓青銅峽、紅寺堡和銀川3個子產區的赤霞珠為原料,采用自然和接種發酵,對酒精發酵和蘋乳發酵后的葡萄酒中的揮發性化合物進行了研究分析,以探索不同子產區的原料在自然和接種條件下的發酵對葡萄酒揮發性化合物種類和含量的影響。研究有助于了解賀蘭山東麓不同子產區的風土特色,為自然發酵葡萄酒和地域風土特色葡萄酒的生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：2017年份寧夏賀蘭山東麓青銅峽、紅寺堡和石嘴山3個子產區的赤霞珠葡萄。

試劑：4-甲基-2-戊醇(色譜純),日本TCI公司；NaCl,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent 7890B-7000D)、DB-WAX色譜柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm),美國安捷倫科技有限公司；進樣器(PAL RSI 85),瑞士CTC公司；萃取頭CAR/PDMS/DVB(23 Ga,1 cm),美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵實驗設計

對采收的葡萄進行常規前處理,在該過程中不添加SO2。酒精發酵每個子產區采用2個180 L控溫不銹鋼發酵罐,裝入約130 L除梗破碎后的葡萄醪,溫度控制在25～28 ℃,每隔12 h打一次循環并測定溫度和比重值。在酒精發酵結束采樣后將2個罐的酒進行混合,分裝滿于 20 L不銹鋼發酵罐中進行蘋乳發酵,溫度設定為18～20 ℃。其中2個進行自然蘋乳發酵；另外2個接種法國諾盟生物科技有限公司的商業乳酸菌進行發酵,在此過程中,每隔48 h取一次樣用于蘋果酸-乳酸細菌的分離和蘋果酸的測定。酒精發酵和蘋乳發酵結束后的葡萄酒分別取樣離心后,取上清液封裝放入-20 ℃的冰箱冷凍保存待測定。

1.3.2 揮發性物質測定

(1)樣品前處理

將冷凍在-20 ℃冰箱中的酒樣取出放在裝滿冰塊的盒子中自然解凍。配制內標：使用12.48 μL 4-甲基-2戊醇,定容到10 mL。解凍完成后,在20 mL頂空瓶中加1.5 g NaCl、5 mL酒樣、10 μL 4-甲基-2-戊醇內標(2.01 mg/L),密封頂空瓶。

(2)HS-SPME條件

使用1 cm 23 Ga DVB/CAR/PDMS纖維(Supelco),萃取前250 ℃老化10 min。在250 r/min、40 ℃下平衡5 min,然后在40 ℃,250 r/min下萃取30 min后進樣,進樣口溫度240 ℃,解吸10 min。

(3)GC條件

使用 DB-WAX(30 mm×0.25 mm, 0.25 μm, Agilent)色譜柱,不分流進樣,載氣高純氦氣(≥99.999%),起始柱溫40 ℃,恒溫5 min,然后依次以3 ℃/min升到97 ℃,以2 ℃/min升到120 ℃,以3 ℃/min升到150 ℃,以8 ℃/min升到220 ℃,保持10 min。

(4)MS條件

EI電離源：離子源溫度230 ℃,傳輸線溫度240 ℃,轟擊電壓70 eV,掃描范圍40～300 u。

(5)定性與定量分析

通過NIST 2017質譜庫,按文獻的保留指數(retention index,RI)與計算RI對照定性。將C9-C20烷烴混合標準樣品加入模擬酒,根據保留時間(retention time,RT)和對應烷烴的RI來計算未知香氣物質的RI值。計算如公式(1)所示：

(1)

式中：RI,計算化合物保留指數；n,n個碳原子數的正構烷烴的峰頂保留時間,min；N,n個碳原子數的正構烷烴的峰尾保留時間,min；ti,化合物保留時間,min；t0,空氣峰,平均流速下的死時間u=L/t0,min。

選用4-甲基-2-戊醇做內標,對揮發性成分進行相對面積定量分析。計算如公式(2)所示：

(2)

1.4 數據處理

采用Microsoft Office 2019進行基本圖表制作,采用R(3.6.2)統計分析軟件的agricolae、FactoMineR 和pheatmap程序包分別對揮發性化合物進行顯著性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 酒精發酵及蘋乳發酵過程控制

酒精發酵每隔12 h測定溫度和比重值,當比重下降到0.992左右時,通過品嘗和殘糖含量的測定確定酒精發酵結束。蘋乳發酵開始后,每2～5 d測1次蘋果酸含量的變化,以此來監測蘋乳發酵情況,結果如圖1所示。3個子產區自然發酵和接種發酵葡萄酒的蘋乳發酵均能完成,相對于接種蘋乳發酵,自然蘋乳發酵的啟動和完成相對緩慢。

Q1-青銅峽自然發酵葡萄酒；Q2-青銅峽接種發酵葡萄酒；H1-紅寺堡自然發酵葡萄酒；H2-紅寺堡接種發酵葡萄酒；Y1-銀川自然發酵葡萄酒；Y2-銀川接種發酵葡萄酒圖1 不同子產區自然發酵和接種發酵葡萄酒蘋果酸值含量變化Fig.1 Changes of malic acid during spontaneous and inoculated fermentation in different sub-regions

2.2 自然酒精發酵和接種酒精發酵對葡萄酒揮發性成分的影響

寧夏賀蘭山東麓3個子產區自然和接種酒精發酵的葡萄酒中,共鑒定出42種揮發性化合物,包括酯類23種,醇類10種,萜烯類2種,醛酮類4種,3種其他揮發性化合物,僅乳酸異戊酯在紅寺堡赤霞珠酒精發酵后的葡萄酒中未檢出。與一些采用一種或幾種經篩選的酵母[6-7]或乳酸菌[8-9]菌株發酵對葡萄酒香氣進行研究的方式不同,本研究采用的是自然發酵的方式,并同接種發酵的葡萄酒進行比較。3個子產區自然酒精發酵和接種酒精發酵葡萄酒中各類揮發性化合物的含量如圖2所示。

Q-青銅峽產區；H-紅寺堡產區；Y-銀川產區；1-自然發酵；2-接種發酵(下同)圖2 青銅峽、紅寺堡和銀川產區自然和接種酒精發酵葡萄酒中各種揮發性化合物的含量Fig.2 Volatile composition of spontaneous and inoculated AF wines in Qingtongxia, Hongsipu and Yinchuan sub-regions注：每個產區自然發酵與接種發酵之間不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2.1 青銅峽產區自然酒精發酵和接種酒精發酵對葡萄酒中揮發性化合物的影響

青銅峽產區自然酒精發酵和接種酒精發酵的葡萄酒中的揮發性化合物在種類及含量上均以酯類為主,其次是醇類,還含有少量的萜烯類、醛酮類和其他幾類揮發性化合物。由圖2可知,其他含量較低的揮發性化合物以及各類揮發性化合物的總量在自然酒精發酵和接種酒精發酵的葡萄酒中均無顯著性差異,僅從均值來看,自然酒精發酵葡萄酒中各類揮發性化合物(除醇類外)的含量及它們的總量均高于接種酒精發酵的葡萄酒,說明該產區可能存在有利于形成葡萄酒香氣的優良酵母。

2.2.2 紅寺堡產區自然酒精發酵和接種酒精發酵對葡萄酒中揮發性化合物的影響

紅寺堡產區自然酒精發酵和接種酒精發酵的葡萄酒中,酯類物質在數量上雖然最多,但在含量上以醇類為主,其次是酯類,同樣還含有少量的萜烯類、醛酮類和其他揮發性化合物。由圖2可知,相對于另外2個產區,紅寺堡產區各類揮發性化合物的含量及它們的總量均較低。可能是因為紅寺堡產區的葡萄所積累的揮發性物質含量較低。

2.2.3 銀川產區自然酒精發酵和接種酒精發酵對葡萄酒中揮發性化合物的影響

銀川產區與紅寺堡產區相似,自然酒精發酵和接種酒精發酵的葡萄酒的揮發性成分在含量上以醇類為主,其次是酯類,同樣還含有少量的萜烯類、醛酮類和其他揮發性化合物。由圖2可知,銀川產區自然酒精發酵的葡萄酒中酯類、醇類和其他揮發性化合物以及它們的總量均低于接種酒精發酵的葡萄酒,但均無顯著性差異。銀川產區葡萄酒各類揮發性化合物及它們的總量僅從均值來看明顯高于另外2個產區,可能是由于該產區的葡萄原料積累的揮發性物質較多。

2.3 自然蘋乳發酵和接種蘋乳發酵對葡萄酒揮發性成分的影響

蘋乳發酵一直以來被認為是干紅葡萄酒發酵過程中改善香氣結構的重要發酵環節,但也有研究表明這一過程并不能對感官品質的改善起到重要作用[10]。本研究中,葡萄酒經蘋乳發酵后,揮發性化合物的種類基本沒變,僅含量上有所變化,此產區酒精發酵的葡萄酒中沒有檢出乳酸異戊酯,可能是由于該物質本身含量較低,此產區葡萄酒揮發性化合物的含量又總體相對較低,所以未檢出。3個子產區自然和接種蘋乳發酵后葡萄酒中各類揮發性化合物的含量如圖3所示。

圖3 青銅峽、紅寺堡和銀川產區自然和接種蘋乳發酵葡萄酒中各種揮發性化合物的含量Fig.3 Volatile composition in spontaneous and inoculated MLF wines in Qingtongxia, Hongsipu and Yinchuan sub-regions

2.3.1 青銅峽產區自然蘋乳發酵和接種蘋乳發酵對葡萄酒中揮發性化合物的影響

青銅峽產區自然和接種蘋乳發酵后葡萄酒中揮發性化合物在數量和含量上均以酯類為主,醇類次之,還含有少量其他揮發性化合物。由圖3可知,青銅峽產區自然蘋乳發酵和接種蘋乳發酵葡萄酒中幾類揮發性化合物含量及它們的總量均無顯著性差異,但僅從均值來觀察,青銅峽產區自然蘋乳發酵后葡萄酒中的醇類、萜烯類、醛酮類以及各類揮發性化合物的總量均較接種蘋乳發酵的葡萄酒高。此外,幾種醇類物質中含量最高的苯乙醇在自然蘋乳發酵葡萄酒中的含量明顯高于接種蘋乳發酵葡萄酒,苯乙醇是葡萄酒中一種重要的高級醇[11],它能給葡萄酒帶來玫瑰、花粉和香水香氣。自然蘋乳發酵葡萄酒中的揮發性化合物在總量和質量上相對接種蘋乳發酵葡萄酒更有優勢,說明該產區可能存在利于本土葡萄酒蘋乳發酵和提高葡萄酒質量的優良蘋乳發酵菌株。

2.3.2 紅寺堡產區自然蘋乳發酵和接種蘋乳發酵對葡萄酒中揮發性化合物的影響

紅寺堡產區自然蘋乳發酵和接種蘋乳發酵葡萄酒中揮發性化合物在含量上以醇類為主,酯類次之,還含有少量其他揮發性化合物。由圖3可知,紅寺堡產區自然蘋乳發酵的葡萄酒中的酯類(P<0.05)、萜烯類(P<0.01)及揮發性化合物的總量(P<0.05)均顯著低于接種蘋乳發酵的葡萄酒。

2.3.3 銀川產區自然蘋乳發酵和接種蘋乳發酵對葡萄酒中揮發性化合物的影響

銀川產區自然蘋乳發酵和接種蘋乳發酵葡萄酒中揮發性化合物在含量上以醇類為主,酯類次之,還含有少量其他揮發性化合物。由圖3可知,僅從均值來觀察,銀川產區自然蘋乳發酵葡萄酒中各類揮發性化合物的含量及它們的總量均低于接種蘋乳發酵的葡萄酒,其中自然蘋乳發酵的醇類(P<0.05)、萜烯類(P<0.05)和醛酮類(P<0.01)顯著低于接種蘋乳發酵葡萄酒。

2.4 各子產區葡萄酒揮發性成分的研究探討

酯類和醇類物質在3個子產區葡萄酒中含量相對較高,其次為醛酮類和其他揮發性化合物。從3個子產區揮發性化合物的總量來看,銀川產區最高(339.05～453.89 mg/L),其次為青銅峽產區(202.10～312.80 mg/L),紅寺堡產區最低(134.00～175.72 mg/L)。銀川產區葡萄酒中的醇類總量、醛酮類總量和其他化合物的總量較另外2個產區高,青銅峽產區的酯類總含量較另外2個產區高。為了進一步探討產區間2種發酵方式下2個發酵階段葡萄酒揮發性成分的差異,進一步對3個產區2種發酵方式、2個發酵階段葡萄酒中的揮發性成分進行主成分分析和聚類分析。

2.4.1 三個子產區蘋乳發酵前后揮發性成分主成分分析

分別對青銅峽、紅寺堡和銀川3個子產區蘋乳發酵前后的揮發性成分進行主成分分析,分別提取2個主成分(Dim)。由圖4可知,酒精發酵后葡萄酒中揮發性化合物的Dim1和Dim2分別為42.71%和28.80%,累計方差貢獻率為71.51%,蘋乳發酵后葡萄酒揮發性化合物的Dim1和Dim2分別為39.50%和29.56%,累計方差貢獻率為69.06%。由葡萄酒個體因子分布圖可知,3個產區的葡萄酒可實現較好的產區分布。且從揮發性成分的變量因子圖和葡萄酒的個體因子圖的分布來看,與蘋乳發酵前相比,蘋乳發酵后不同揮發性成分對不同產區葡萄酒的貢獻有所變化。

青銅峽產區酒精發酵后的葡萄酒分布在第四象限,位于第四象限內的丁酸乙酯、月桂酸乙酯和葵酸乙酯等揮發性化合物對該產區葡萄酒香氣的貢獻較其他產區顯著；紅寺堡產區酒精發酵后的葡萄酒分布在第二象限,位于第二象限內的苯甲醇、異丁醇和正癸醇對該產區葡萄酒的香氣貢獻較其他產區顯著；銀川產區酒精發酵后的葡萄酒主要分布在第一象限,位于第一象限內的己酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇等揮發性成分對該產區葡萄酒的香氣貢獻較其他產區顯著。從酒精發酵后的主成分分析結果看,大多數揮發性化合物對銀川產區和青銅峽產區的香氣貢獻更明顯。蘋乳發酵結束后,揮發性成分的變量因子圖和葡萄酒的個體因子圖的分布均有所變化,各類揮發性成分對不同產區葡萄酒的貢獻度也產生變化,其中,蘋乳發酵后對青銅峽產區葡萄酒貢獻相對顯著的揮發性化合物數量明顯增加,青銅峽產區蘋乳發酵后的葡萄酒分布在第一、二象限,位于一、二象限內的丁酸乙酯、癸醛和辛酸異戊酯等揮發性化合物對該產區葡萄酒的香氣貢獻較其他產區顯著；與之相反,蘋乳發酵后對另外2個產區葡萄酒香氣貢獻較為顯著的揮發性化合物的數量明顯減少,紅寺堡產區蘋乳發酵后的葡萄酒香氣分布于第三象限,乙酸己酯對其貢獻較其他產區顯著；銀川產區蘋乳發酵后的葡萄酒分布在第四象限,位于第四象限內的異戊醇、苯乙醇和乙酸苯乙酯等揮發性化合物對該產區葡萄酒的香氣貢獻較其他產區顯著。分析結果較好地體現了各類揮發性化合物在蘋乳發酵前后,在幾個產區葡萄酒中含量的消長變化。

a-酒精發酵(AF)后變量因子圖;b-AF后個體因子圖;c-蘋乳發酵(MLF)后變量因子圖;d-MLF后個體因子圖1-自然發酵；2-接種發酵；cf-重復圖4 酒精發酵后及蘋乳發酵后揮發性成分變量因子圖及個體因子圖Fig.4 Variable factor and individual factor graphs of volatile components after alcoholic and malolactic fermentation

2.4.2 三個子產區蘋乳發酵前后揮發性成分聚類分析

對青銅峽、紅寺堡和銀川3個子產區蘋乳發酵前后的揮發性成分進行聚類分析,進一步驗證3個子產區在2種發酵方式下葡萄酒香氣化合物的變化。實現不同發酵階段、不同發酵方式及不同產區的聚集。由圖5可知,對葡萄酒中揮發性成分影響程度由強到弱的因素依次為產區、發酵階段、發酵方式。

揮發性化合物由上到下被聚為4大類,這4大類化合物在相對含量上的差異較好地實現了青銅峽、紅寺堡和銀川產區的分離,整體上,每個產區葡萄酒中的揮發性化合物的相對含量相對其他產區相近。每個產區蘋乳發酵前后揮發性化合物相對含量又存在差異,可以較為直觀地實現蘋乳發酵前后2個發酵階段的分離,其中,青銅峽產區酒精發酵結束后的葡萄酒中第一類以酯類為主的揮發性化合物的含量相對較高,蘋乳發酵結束后的葡萄酒中第二類以醛酮類和酯類為主的化合物含量相對較高；紅寺堡產區相對于青銅峽產區和銀川產區而言,大部分揮發性化合物的含量均較低,僅酒精發酵后以醇類為主的第三類化合物在幾個產區中含量相對較高；銀川產區的葡萄酒中以酯類和醇類為主的第四類化合物的相對含量較高,此類揮發性化合物又分為兩小類,可以很直觀地觀察到蘋乳發酵前后揮發性化合物在相對含量上的區別。

圖5 不同產區2種發酵方式下蘋乳發酵前后揮發性化合物聚類熱圖Fig.5 Cluster heat map of volatile compounds of wines before and after MLF under two fermentation treatment in three sub-regions注：同一行代表同種物質在不同酒樣中的含量,上方的聚類樹根據不同酒樣各類揮發性化合物含量的相似度進行聚類,揮發性化合物含量由低到高用從藍到紅表示

由圖5中各種物質顏色深淺變化可以觀察到,3個產區的葡萄酒蘋乳發酵結束后大部分揮發性化合物的含量降低,也有部分揮發性化合物的含量升高,其中乳酸乙酯、乳酸異戊酯、丁二酸二乙酯、正辛醇、2, 4-二甲基苯甲醛和2, 4-二叔丁基酚在3個產區自然及接種蘋乳發酵后的葡萄酒中普遍升高,這與之前一些研究者的研究結果相符[12],但不同產區的部分揮發性化合物的變化會略有不同。例如,除上述物質在蘋乳發酵后上升外,青銅峽產區的葡萄酒中辛酸異戊酯和異丁醇的含量在蘋乳發酵后升高；紅寺堡產區的葡萄酒中正己酸乙酯和正己醇在蘋乳發酵后上升；銀川產區的葡萄酒中3-羥基丁酸乙酯、乙酸苯乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十六酸乙酯、正丁醇、苯甲醇、苯乙醇和香茅醇的含量升高。此外,與銀川產區和紅寺堡產區不同,青銅峽自然發酵的葡萄酒中蘋乳發酵前后揮發性化合物的含量大多較對應階段接種發酵葡萄酒中揮發性化合物含量高。可能是由于存在利于產生更多揮發性物質的本土優良菌株。

3 結論

本研究通過對賀蘭山東麓產區3個子產區自然和接種發酵的葡萄酒中揮發性成分進行了分析,從3個子產區均鑒定出42種揮發性化合物,包括酯類23種,醇類10種,萜烯類2種,醛酮類4種,還有3種其他揮發性化合物,其中,酯類和醇類的含量相對較高。青銅峽子產區自然酒精發酵后各類揮發性化合物的含量(除醇類外)及總量均高于接種酒精發酵的葡萄酒,自然蘋乳發酵后各類揮發性化合物的含量(除酯類外)及總量均較高于種蘋乳發酵的葡萄酒。紅寺堡子產區自然發酵和接種發酵的葡萄酒中各類揮發性化合物在3個子產區中的含量均最低,該子產區自然酒精發酵后各類揮發性化合物的含量和總量均較接種酒精發酵的葡萄酒低,自然蘋乳發酵后葡萄酒中絕大多數揮發性化合物的含量均低于接種蘋乳發酵的葡萄酒。銀川子產區葡萄酒中各類揮發性化合物的含量是3個子產區中含量最高的,該子產區自然酒精發酵的葡萄酒中各類揮發性化合物及它們的總量均低于接種酒精發酵的葡萄酒,銀川子產區自然蘋乳發酵后的葡萄酒中各類揮發性化合物的含量及它們的總量均低于接種蘋乳發酵的葡萄酒。通過分析蘋乳發酵后葡萄酒中揮發性化合物的含量變化,發現乳酸乙酯、乳酸異戊酯、丁二酸二乙酯、正辛醇、2, 4-二甲基苯甲醛和2, 4-二叔丁基酚在3個子產區自然和接種蘋乳發酵后的葡萄酒中普遍升高,但不同子產區間的其他揮發性化合物含量的變化會有所不同。總體來看,青銅峽產區自然酒精發酵與自然蘋乳發酵的葡萄酒中大多數揮發性化合物的含量均高于接種發酵對應發酵階段的葡萄酒,該產區可能存在可以產生更多揮發性化合物的本土優良菌株。此外,本研究發現對葡萄酒中揮發性化合物影響程度從高到低依次為子產區、發酵階段和發酵方式。