黃酒生物酸化浸米與浸米漿水的利用

張波,謝廣發,李國龍,孫國昌,金建明,朱煒俊,劉菊

1(浙江經貿職業技術學院,浙江 杭州,310018)2(浙江樹人大學 生物與環境工程學院,浙江 紹興,312028) 3(紹興黃酒學院,浙江 紹興,312028)4(紹興鑒湖釀酒有限公司,浙江 紹興,312000) 5(會稽山紹興酒股份有限公司,浙江 紹興,312000)

黃酒是我國獨有的、歷史最悠久酒種之一,千百年來深受人們的喜愛并流傳至今[1]。浸米是黃酒釀造過程中的重要環節,不僅使大米充分吸水膨脹以便于蒸煮,更能使米酸化,來調節發酵醪液的酸度,保障黃酒發酵安全進行[2-3]。傳統浸米工藝時間長,所釀黃酒生物胺含量高[4]。浸米過程中會產生大量米漿水,含有大量的氮磷等有機質,直接作廢水處理會給黃酒企業以及環境帶來較大的壓力[5-6]。生產過程中,因雜菌污染,經長時間浸米后得到的米漿水往往會產生“白花”和異嗅味[7]。這種米漿水直接回用會給黃酒帶來不良風味,且易引起發酵醪液酸敗。

近年來,針對黃酒浸米漿水中微生物群落結構以及米漿水的利用開展了大量的研究。由于黃酒自然浸米,米漿水中微生物群落結構復雜，毛青鐘等[8]通過傳統微生物培養方法,發現浸米漿水中含有細菌、霉菌、酵母等微生物。通過現代分子生物學技術研究黃酒浸米漿水中的細菌群落結構,發現乳酸菌是浸米漿水中的優勢細菌,種類繁多且數量占據優勢[9-12]。其大量產酸為發酵提供酸性環境,抑制雜菌生長,保證酵母正常代謝[13],而乳酸菌也是產生物胺的主要微生物之一[14-15]。因此如何在滿足浸米產酸需求的同時減少生物胺的生成是亟需解決的問題。目前對米漿水利用主要是將其作為黃酒生產投料用水,通常會將米漿水經加熱殺菌并冷卻后再使用[16]。然而加熱殺菌和冷卻均會消耗大量的能源,用量較大時會使釀制黃酒中的高級醇、乙醛等微量有害組分增加[17],且氨基酸態氮和總酸含量大幅提高,對產品的安全性和口感造成不利影響。李海霞等[18]將米漿水用于循環浸米,使米漿水得到部分回用。在實際生產中,米漿水中乳酸菌多而有害雜菌少時,將老漿用于接種浸米,有利于浸米生酸。但由于自然浸米雜菌易生長繁殖,用老漿接種浸米很容易產生異嗅味。

本研究模擬自然浸米過程中乳酸菌發酵產酸過程,從浸米漿水中篩選出合適的乳酸菌進行生物酸化浸米,以消除米漿水異嗅味并降低生物胺含量,進一步將米漿水用于循環浸米和代替部分投料水使用。在保證黃酒品質和安全前提下的米漿水循環利用,對于減少廢水排放,實現清潔化生產具有重要的現實意義,同時也具有良好的經濟效益、社會效益和生態效益。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

糯米、生麥曲、熟麥曲,取自紹興某黃酒廠；安琪活性干酵母。

1.1.2 試劑與儀器

NaOH、NaCl、MgSO4、FeSO4、K2HPO4、CaCO3、CuSO4、檸檬酸銨、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、5-磷酸吡哆醛,L-組氨酸,L-酪氨酸,L-鳥氨酸等,均為分析純,中國國藥化學試劑有限公司。

LBI-250恒溫培養箱,上海龍躍儀器設備有限公司；G180DS滅菌鍋,致微(廈門)儀器有限公司；E200MV電子顯微鏡,南京尼康江南光學儀器有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀,美國安捷倫公司；UV—5500紫外分光光度計,上海元析儀器有限公司；KA-1000離心機,上海安亭科學儀器廠；FE28型pH計,梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.1.3 培養基

MRS培養基、GYP培養基,按參考文獻[19]配制;米飯糖化液培養基：糖化液取自紹興某酒廠,用0.1 mol/L NaOH溶液調至pH為6.2左右,加水稀釋糖度為7～8°Brix,加1%檸檬酸銨；液體脫羧酶培養基,按參考文獻[20]配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 浸米漿水中乳酸菌的分離篩選

稱取100 g糯米加150 mL水于28 ℃浸米3～5 d,過濾得到米漿水,用無菌水梯度稀釋到不同濃度(10-1～10-3)并涂布于平板底部,GYP培養基覆蓋,33 ℃條件下培養3 d,根據有無透明圈來初步判斷是否為乳酸菌[21]。挑取透明圈較大的菌落在MRS培養基上進行劃線純化,并進行革蘭氏染色[22]。

1.2.2 乳酸菌生長和產酸能力測定

將純化后的菌株用MRS培養基于33 ℃活化48 h,取活化菌液以5%接種量接種到米飯糖化液培養基中,于33 ℃靜置培養48 h,分別測定發酵液OD600值和總酸含量。

1.2.3 低產生物胺乳酸菌的篩選

將浸米漿水中分離出的乳酸菌接種于液體脫羧酶培養基,33 ℃培養96 h觀察顏色變化。然后離心取上清液,采用HPLC法檢測生物胺含量[20,23],同時做空白對照。

1.2.4 乳酸菌的分子鑒定

提取DNA后,進行16S rDNA擴增,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析,由上海生物工程有限公司進行序列測定,美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數據庫進行比對,使用MEGA7.0構建生物系統進化樹[3, 13]。

1.2.5 生物酸化浸米漿水循環回用浸米

生物酸化浸米：稱取100 g糯米以料液比1∶1.5(g∶mL)加入水,接種體積分數為5%的乳酸菌種子液,于28 ℃浸米3 d。以自然浸米為對照,觀察浸米漿水的形態和品質,測定總酸、pH、OD600值。

生物酸化浸米漿水循環回用浸米：稱取100 g糯米于250 mL三角瓶中(4份),按照料液比1∶1.5(g∶mL),使用生物酸化浸米結束后,過濾靜置澄清的米漿水按照體積分數為20%、30%、40%、50%的比例代替自來水開始浸米3 d。完成第1次循環后,將第1次浸米結束后的浸米漿水經紗布過濾靜置澄清后,按照回用比例用于第2次循環浸米,以此類推進行生物酸化浸米漿水的循環回用實驗,浸米結束后測定pH、總酸、OD600值等理化指標。

1.2.6 生物酸化浸米米漿水回用釀酒實驗

稱取1 kg糯米,按照料液比1∶1.5(g∶mL)加水,接種體積分數為5%乳酸菌種子液并攪拌均勻,于28 ℃浸米3 d?；赜玫慕诐{水70 ℃保溫30 min。采用常壓蒸煮方式蒸熟米飯后攤開冷卻,按米水比1∶1.15(g∶mL)的比例向酒壇中加入投料水(浸米漿水回用比例為20%),加入冷卻的米飯,依次投入生麥曲130 g、熟麥曲30 g、1.5 g活性干酵母(需先活化20 min),均勻攪拌。在29 ℃條件下發酵,前3 d每天調低3～4 ℃,到第4天時溫度調至15 ℃,保持此溫度直至后酵結束。前酵階段定時開耙,后酵階段靜置培養。以自然浸米釀酒為對照,跟蹤發酵過程中第4、7、14、21 天的總酸、還原糖、酒精度的變化,黃酒理化指標分析參考GB/T 13662—2018《黃酒》[24]。感官品評邀請國家黃酒評酒委員進行品評打分。

2 結果與分析

2.1 適合生物酸化浸米的乳酸菌的篩選

2.1.1 浸米漿水中乳酸菌的分離篩選

將黃酒自然浸米過程中第3～5天浸米漿水通過稀釋分離培養的方法涂布于GYP培養基上,在33 ℃恒溫培養72 h,挑選出透明圈較大的菌株進行劃線分離純化,并經革蘭氏染色為陽性的菌株,如圖1所示,共得到65株菌株。

a-菌株透明圈；b-革蘭氏染色圖1 GYP培養基中的菌株透明圈及革蘭氏染色情況Fig.1 Transparent circle and gram staining of the strain in GYP medium

2.1.2 菌株的生長和產酸實驗

將上述65株菌接種于米飯糖化液培養基中,33 ℃培養48 h,分別測定其OD600值和總酸,觀察其生長和產酸情況。選取總酸>4 g/L,OD600值>0.500的菌株,共得到20株菌,這部分菌株的總酸和OD600值如圖2所示。在相同培養條件下,B1、C6、D3、F4、F6菌株OD600≥1.0,且總酸≥5.5 g/L,為生物酸化浸米初篩菌株。

圖2 部分菌株培養48 h后的OD600值和總酸Fig.2 OD600 and total acid of some strains cultured for 48 h

2.1.3 菌株產生物胺實驗

將挑選出的20株菌接種于液體脫羧酶培養基中于33 ℃培養96 h,以未接種乳酸菌的培養基為空白對照。菌株產生物胺能力越強,培養基顏色越深,觀察液體脫羧酶培養基顏色變化,以“+”表示培養基顏色深淺,結果如表1所示。剔除液體脫羧酶培養基顏色較深的6株菌株B1、B4、E2、F6、G2、G5,剩余14株菌體培養液離心后使用反相HPLC上機檢測生物胺(腐胺、組胺、酪胺)含量進行進一步確認,其結果如圖3所示。不同菌株產生物胺能力不同,其中產生腐胺含量為21.30～114.20 mg/L,產生酪胺含量為10.46～30.81 mg/L,產生組胺含量為1.18～4.58 mg/L。生物胺總量在33.23～146.74 mg/L。產生物胺量較低菌株有A7、D3、F3。

表1 分離篩選出的菌株產生物胺能力對比(液體脫羧酶培養基)Table 1 Comparison of biogenic amine production capacity of isolated and screened strains

圖3 分離篩選出的菌株產生物胺能力對比Fig.3 Comparison of biogenic amine production capacity of isolated and screened strains

2.1.4 16S rDNA的分子生物學鑒定

根據圖2和圖3綜合分析,D3的OD600值和總酸較高,且產生物胺能力較低,適合成為黃酒生物酸化浸米的目標菌株。目標菌株經16S rDNA擴增,瓊脂糖凝膠電泳后得到約1 500 bp擴增產物。菌種測序后經過Blast序列比對,MEGA7.0構建系統進化樹,結果如圖4所示。菌株D3與LactobacillusplantarumNRPL B—14768親緣關系最近,可以確定D3菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

2.2 生物酸化浸米漿水的循環回用浸米

2.2.1 生物酸化浸米漿水的品質及形態觀察

接種乳酸菌D3種子液進行生物酸化浸米培養3 d,以自然浸米為對照,觀察浸米漿水的品質和形態。自然浸米的浸米漿水氣味不宜,有異嗅味和“白花”狀物質。而生物酸化浸米漿水氣味良好,表面無“白花”,品質比較均一。不同浸米方式米漿水的總酸和pH測定結果見表2。生物酸化浸米3 d已經使米漿水總酸達到了8.43 g/L,而自然浸米3 d時總酸只有4.55 g/L,直到5 d才達到8.50 g/L。說明生物酸化浸米能加快浸米進程,可有效縮短浸米時間2 d。

圖4 基于16S rDNA序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

表2 不同浸米方式的米漿水pH和總酸含量對比Table 2 pH and total acid content of rice water in different ways of soaking rice

2.2.2 生物酸化浸米漿水的循環回用浸米

生物酸化浸米3 d結束后的浸米漿水經紗布過濾靜置澄清后,按照體積分數為20%、30%、40%、50%的比例替代自來水繼續用于下一次生物酸化浸米,浸米結束后測定pH、總酸、OD600值。跟蹤了9批次生物酸化浸米漿水循環回用過程,觀察其指標的動態變化,其結果如圖5所示。

由圖5可知,隨著生物酸化浸米漿水循環回用次數的增加,最初乳酸菌不斷富集,所分泌的乳酸等使得總酸含量升高,浸米漿水的pH降低,同時米漿水中OD600值逐漸增加,第3次循環回用時總酸、pH和OD600已基本趨于穩定。對比自然浸米5 d的總酸為8.50 g/L,生物酸化浸米漿水回用比例為20%的總酸較低,達不到抑制雜菌的目的。而40%和50%的總酸則太高,不利于黃酒的釀造。循環3次后米漿水回用比例為30%時總酸為8.52 g/L,與自然浸米5 d的總酸基本相近,因此確定最適宜米漿水回用比例為30%。

a-pH；b-總酸；c-OD600圖5 黃酒生物酸化浸米漿水循環回用過程中pH、總酸和OD600值變化Fig.5 Changes of pH,total acid and OD600 in the water recycling process of rice soaked by biological acidification of Chinese rice wine

2.3 生物酸化浸米漿水回用釀酒實驗

浸米是黃酒釀造的第一步,采用生物酸化浸米能夠縮短浸米時間,提高浸米漿水酸度。黃酒是最終發酵產品,需通過黃酒釀造實驗探討生物酸化浸米對其影響,進一步探討生物酸化浸米的可行性。稱取1 kg糯米分別采用生物酸化浸米3 d和自然浸米5 d,然后進行黃酒釀造實驗,其中生物酸化浸米在釀酒投料時以20%浸米漿水來代替自來水進行投料,分別測定發酵過程中第4、7、14、21天的總酸、酒精度、還原糖的變化,結果如圖6所示。黃酒發酵過程中總酸呈現先快后慢上升趨勢,生物酸化浸米的起始酸度高于自然浸米,但兩者最終無明顯差異,原因可能是投料時酸度增加抑制了產酸雜菌的生長。生物酸化浸米釀酒的酒精度較高,一方面由于浸米時間縮短減少了原料的淀粉損失,另一方面浸米水中較豐富的營養物質有利于酵母的生長和發酵。2種浸米方式對發酵過程和發酵結束后還原糖含量無明顯影響。

a-總酸；b-酒精度；c-還原糖圖6 不同浸米方式釀酒過程中的總酸、酒精度、還原糖對比Fig.6 Total acid, alcohol content and reducing sugar during fermentation process in different ways of soaking rice

對后酵結束后壓榨的黃酒進行理化指標測定和感官品評,結果如表3所示。對照GB/T 17946—2008《地理標志產品 紹興酒(紹興黃酒)》[25],所釀制的黃酒符合紹興黃酒國家標準中優等品要求。生物酸化浸米釀制的黃酒總酸、總糖和非糖固形物與自然浸米釀造的黃酒無明顯差異,酒精度和氨基酸態氮高于自然浸米釀造的黃酒。酒精度提高是由于浸米時間縮短、浸米過程淀粉損失降低及米漿水中帶入有利于酵母生長的營養物質所致。氨基酸態氮提高是由于米漿水回用帶入一定量的氨基酸所致,黃酒中氨基酸態氮含量適當提高有利于酒的醇厚性。經多名評酒委員品評認為,生物酸化浸米所釀黃酒與自然浸米所釀黃酒的感官質量無明顯差異,且前者要略優于后者。同時,由于生物酸化浸米使用低產生物胺的菌株D3,能降低黃酒生物胺含量64.3%,對黃酒釀造的安全性有著積極意義。

表3 不同浸米工藝黃酒后酵結束后指標測定Table 3 Indexes of Chinese rice wine after the fermentation by different ways of soaking rice

3 結論

傳統的自然浸米時間長,浸米漿水處理成本高昂。本研究利用GYP透明圈和革蘭氏染色從黃酒浸米漿水中分離出65株細菌,并研究其生長產酸以及產生物胺能力,獲得了1株適合用于生物酸化浸米的乳酸菌D3,經過16S rDNA序列分析鑒定該菌株為植物乳桿菌(L.plantarum)。

將其應用于生物酸化浸米,對比自然浸米,生物酸化浸米漿水無不良氣味,且縮短浸米時間2 d。將生物酸化浸米漿水靜置澄清后循環回用,隨著乳酸菌的不斷積累,浸米漿水中的總酸升高,pH降低。循環回用3次后基本保持穩定,參照自然浸米的總酸,確定浸米漿水回用的比例為30%。

將生物酸化浸米(浸米漿水回用20%替代投料水)和自然浸米用于黃酒的釀造實驗,跟蹤發酵過程中第4、7、14、21天總酸、酒精度、還原糖的變化,發現生物酸化浸米釀酒的酒精度要高于自然浸米釀造的黃酒。對后酵結束后壓榨的黃酒進行各項理化指標測定和感官品評,均符合GB/T 17946—2008《地理標志產品 紹興酒(紹興黃酒)》的標準。因此生物酸化浸米漿水回用于循環浸米和投料是可行的,且具有良好的經濟效益和生態效益。