乳酸菌和酵母菌發酵紅棗汁工藝優化及成分分析

梁鑫,陳思雨,趙育,2,雷鈺,孔倩倩,萬欣,張寶善,2*

1(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院,陜西 西安,710119)2(陜西省果蔬深加工工程技術研究中心,陜西 西安,710119)

紅棗,是中國本土的鼠李目鼠李科棗屬植物果實[1],富含可溶性糖[2]、蛋白質、酚酸類化合物、維生素及礦物質[3],具有一定的抗腫瘤、抗疲勞和預防心血管疾病等功能,被譽為果中補品王[4-5]。據報道,紅棗中糖分質量分數達到50%～80%,蛋白質質量分數達到2.9%～4.0%,維生素C(VC)質量分數達到0.4%～0.6%[6]。乳酸菌是一類可通過發酵消耗糖類產生乳酸的細菌總稱[7],具有維持胃腸道菌群平衡、調節消化免疫系統和改善胃腸道功能等作用[8]。

使用乳酸菌發酵紅棗汁,可以提高發酵產物的總酚含量和抗氧化能力[9-10],而由于乳酸菌是一種營養缺陷型細菌,復合菌株發酵就成為提高產物功能的一個重要途徑。將酵母菌和乳酸菌共同培養時,少量的酵母菌會促進乳酸菌的生長[11-12]。基于此理論,李佩佩等[13]用酵母菌和乳酸菌復合發酵枸杞汁,發酵產物中總酚含量、總酸度和抗氧化能力較單一乳酸菌發酵時均有所提高。

本文以陜北紅棗所制得的紅棗汁為原料,以釀酒酵母、發酵乳桿菌、干酪乳桿菌、短乳桿菌和植物乳桿菌為發酵菌株,探究酵母菌與乳酸菌復合發酵對紅棗汁品質的影響,確定發酵工藝條件并對發酵液進行成分分析,以期開發一種新型紅棗汁乳酸發酵飲品。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

1.1.1 紅棗

陜北紅棗,陜西省榆林市清澗縣。

1.1.2 發酵菌株

酵母菌：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,SC),法國帝伯仕公司；乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)：發酵乳桿菌(LactobacillusfermentumCGMCC 1.1880,LF)、干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiCGMCC 1.575,LC)、植物乳桿菌(LactobacillusplantarumCGMCC 1.908 7,LP),中國普通微生物菌種保藏管理中心；短乳桿菌(LactobacillusbrevisYM 1301,LB),云南省微生物研究所。

1.1.3 主要試劑

麥芽汁培養基、MRS肉湯培養基、瓊脂粉,北京奧博星生物技術有限責任公司；酒石酸鉀鈉、無水乙醇、NaCl、NaOH、KH2PO4、Na2SO3、H2O2、H3PO4(色譜級)、C2H3N(色譜級),天津市科密歐化學試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸、福林酚、2,4-二硝基苯肼、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS),美國Sigma公司。

1.2 試驗儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀器,美國Thermo公司；SW-CJ-1F超凈工作臺,上海躍進醫療器械廠；GSP—9080MBE隔水式恒溫培養箱,上海博迅實業有限公司；L-8900氨基酸分析儀,日本HATACHI公司；PL203電子天平,上海天呈實驗儀器制造有限公司；UV752紫外分光光度儀,尤尼柯(上海)儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 紅棗汁的制備

取1 kg紅棗,清洗后按m(紅棗)∶m(水)=1∶3將紅棗置于清水中,蒸煮使其表皮破裂,冷卻至50 ℃以下后,按照紅棗和水總質量的0.1%添加果膠酶,在50 ℃條件下酶解5 h[14],再經滅酶、過濾,即制得可溶性固形物含量為19%的紅棗汁。

2.2 發酵菌株的活化

LAB活化[15]：將LF、LC、LB和LP這4種LAB接種在MRS固體培養基上,于37 ℃培養箱中培養24 h；之后挑一個單菌落轉接到MRS肉湯中,在37 ℃培養箱中培養24 h；再將MRS肉湯中的LAB轉接到紅棗汁與MRS肉湯以1∶2(體積比)比例混合的培養基中,于37 ℃培養箱中再培養24 h，即得試驗用LAB菌株。

SC活化：按上述方法用麥芽汁培養基對SC進行活化。

發酵菌株菌懸液制備：將上述培養菌株的液體培養基搖勻,取5 mL于無菌離心管中,在4 500 r/min離心15 min,撇去上清液后,用0.85%的無菌生理鹽水清洗、離心,再用生理鹽水調整菌懸液濃度為1×108CFU/mL[16],調整后的菌懸液即作為本次試驗用發酵菌株。

2.3 紅棗汁發酵

取300 mL紅棗汁于500 mL錐形瓶中,在105 ℃條件下濕熱滅菌15 min,冷卻后,分別將SC和LF、LC、LB、LP的菌懸液按照體積分數為2%的接種量接入紅棗汁中,在37 ℃培養箱中培養60 h后,測定發酵液的成分。

2.4 理化指標的測定

總酸：參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》[17]的方法進行測定,結果以乳酸計。產酸率按公式(1)進行計算：

(1)

式中：m總酸,發酵液中生成的酸的質量；m還原糖消耗,發酵液中還原糖被消耗的質量。

可溶性固形物：參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[18],用折光儀法進行測定。

還原糖：采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[19]。以葡萄糖溶液質量濃度為橫坐標,以在540 nm波長處所測吸光值為縱坐標,繪制標準曲線,回歸方程為：y=0.624 1x+0.002 1,R2=0.997 9。

總酚：采用福林酚法測定總酚的含量,總酚的含量以沒食子酸計,單位為mg/L。以沒食子酸標準溶液的質量濃度為橫坐標,以在760 nm波長處所測吸光值為縱坐標,繪制標準曲線,回歸方程為：y=0.062 8x+0.032 7,R2=0.988 5。

VC：采用2,4-二硝基苯肼比色法測定[20],以不同梯度VC的質量濃度為橫坐標,以在500 nm波長處所測吸光值為縱坐標,繪制標準曲線,回歸方程為：y=0.024 2x+0.004 1,R2=0.995 7,VC含量單位為mg/100 mL。

有機酸：參考GB 5009.157—2016《食品安全國家標準 食品有機酸的測定》[21]和實驗室現有方法略有改進,采用高效液相色譜法測有機酸,色譜條件為：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm)；柱溫為30 ℃；紫外檢測波長為210 nm；用磷酸調節pH至2.7的0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相,色譜級乙腈為有機相,V(磷酸二氫鉀溶液)∶V(乙腈)=96.5∶3.5；流速為0.6 mL/min;進樣量為20 μL。待測樣品中有機酸定量方法采用外標法。

氨基酸的測定：參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[22],用全自動氨基酸分析儀對樣品中氨基酸含量進行測定。

2.5 抗氧化能力的測定

2.5.1 DPPH自由基清除能力[23]

取2 mL不同質量濃度的樣品溶液,加入3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液,避光靜置30 min后,以無水乙醇調零,在517 nm波長下測吸光值A樣。參照組用無水乙醇代替DPPH溶液,充分混勻后,在517 nm波長測吸光度A參照；對照組用2.0 mL的DPPH溶液與3.0 mL無水乙醇混勻后在517 nm波長下測吸光度A空白。按公式(2)計算DPPH自由基清除率：

(2)

2.5.2 羥基自由基清除能力[23]

依次向各試管加入2 mL 0.006 mol/L FeSO4溶液,2 mL不同質量濃度樣品溶液和2 mL 0.006 mol/L H2O2溶液,搖勻靜置10 min,再加入2 mL 0.006 mol/L水楊酸溶液,充分反應20 min后,在510 nm處測得樣品吸光度A樣；把水楊酸溶液換成蒸餾水后測得在該樣品濃度下的吸光度A參照；把抗氧化劑換成蒸餾水后,測得空白對照吸光度A空白。以抗壞血酸為對照,按公式(3)計算羥基自由基清除率：

(3)

2.5.3 ABTS陽離子自由基清除能力[23]

取3 mL 7.4 mmol/L ABTS溶液和6 mL 2.6 mmol/L K2S2O7水溶液混勻,避光靜置12 h,再用無水乙醇稀釋40～50倍,調整734 nm波長處的吸光值為0.7±0.02。取各質量濃度下的樣品0.2 mL,加入0.8 mL ABTS溶液后混勻,避光靜置6 min,在734 nm波長下測吸光度A樣；對照組用無水乙醇代替樣品溶液后混勻,避光靜置6 min,在734 nm波長下測吸光度A對照。按公式(4)計算ABTS陽離子自由基清除率：

(4)

2.6 數據統計與處理

各組試驗重復測定3次,結果用平均值±標準偏差表示。本試驗用 Excel 2016和SPSS 23分析試驗數據,采用Duncan新復極差分析法,P<0.05為顯著相關,P<0.01為極顯著相關。

3 結果與分析

3.1 不同菌株發酵對紅棗汁品質的影響

分別用SC與單株的LAB發酵紅棗汁時,對發酵液的總酸度、pH、還原糖殘糖量、總酚、VC和抗氧化能力進行測定。由表1可知,與紅棗汁相比,經SC和LAB發酵60 h的發酵液中總酸度、總酚含量和抗氧化能力均提高,pH、還原糖和VC含量均下降。4株LAB中LP發酵液的總酸度和VC含量最高,分別為8.715 g/L和7.19 mg/100 mL；LF發酵液的總酚含量、ABTS陽離子自由基清除率、DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率均最高,最高值分別為251.71 mg/L、78.73%、86.19%和72.59%；LAB發酵液的總酸度、總酚含量、VC含量和抗氧化能力優于SC。LF和LP的產酸率分別為7.03%和6.99%，其產酸效果較好。

表1 不同LAB和SC發酵的紅棗汁發酵液成分比較Table 1 Components of jujube fermentation broth using different LABs and SCs

3.2 SC與不同LAB復合發酵對紅棗汁品質的影響

為探究SC與不同LAB復合發酵對紅棗汁品質的影響,按2%(體積分數)的接種量、1∶1(體積比)的接種比,分別用SC與LF、LB、LC、LP復合發酵紅棗汁,并測定在37 ℃條件下發酵60 h的各項理化指標。

3.2.1 總酸度、pH和還原糖殘糖量的比較

SC與不同LAB復合發酵對紅棗汁發酵液總酸度、pH和還原糖殘糖量的影響如圖1所示。SC和LP的發酵液中,還原糖殘糖量、總酸度和產酸率分別為6.897 g/100 g、7.877 g/L和5.54%；SC和LF的發酵液中還原糖殘糖量、總酸度和產酸率分別為7.763 g/100 g、7.455 g/L和5.59%,發酵液中還原糖殘糖量和產酸率均高于SC和LP的組合。

圖1 SC與不同LAB的發酵產物中總酸度、pH和還原糖殘糖量的比較Fig.1 Total acidity, pH and residual sugar content of reducing sugars in different SCs and LABs fermentation products

3.2.2 總酚含量和維生素C含量的比較

SC與不同LAB復合發酵對紅棗汁發酵液總酚和維生素C含量的影響如圖2所示。SC和LF的發酵液中總酚含量最高,為275.71 mg/L；SC和LP的發酵液中VC含量較SC和LF的發酵液高0.5 mg/100 mL,可能由于SC和LP的發酵液中總酸度相對較高,對VC起到了一定的保護作用。

圖2 SC與不同LAB的發酵產物中總酚和VC含量的比較Fig.2 Content of total phenol and VC in fermentation products of different SCs and LABs

3.2.3 抗氧化能力的比較

SC與不同LAB復合發酵對紅棗汁發酵液抗氧化能力的影響如圖3所示。SC和LF的發酵液中ABTS陽離子自由基清除率、DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率分別為82.65%、86.37%和75.26%；SC和LP的發酵液的3種自由基清除率分別為76.47%、87.19%和72.25%。就抗氧化能力而言,SC與LF的組合優于SC與LP的組合。

與表1相比,復合發酵時,發酵液的總酚含量和抗氧化能力均小幅優于單一菌株發酵。綜合圖1、圖2和圖3的結果分析,SC和LP復合發酵時,發酵液中總酸度、DPPH自由基清除率最高,VC含量相對較高；而SC和LF復合發酵時,發酵液中還原糖殘糖量、總酚含量、ABTS陽離子自由基清除率和羥基自由基清除率均最高,產酸率相對較高。從還原糖利用率及發酵液抗氧化能力的角度考慮,SC和LF為本試驗發酵紅棗汁的最優菌株組合。

圖3 SC與不同LAB發酵產物抗氧化能力的比較Fig.3 Antioxidant capacity of fermented products from different SCs and LABs

3.3 SC和LF接種比例對紅棗汁發酵液的影響

為確定SC和LF復合發酵紅棗汁的最佳接種比例,按照2%(體積分數)的總接種量,7個不同的接種比,在37 ℃條件下發酵60 h,測定紅棗汁發酵液的各項理化指標。

3.3.1 SC和LF接種比例對總酸度、pH和還原糖殘糖量的影響

不同比例的SC和LF對發酵液總酸度、pH和還原糖殘糖量的影響如圖4所示。不同組發酵液中總酸度和還原糖殘糖量隨著SC接種比例的增加而減少,可能是因為此時酵母菌進行的酒精發酵在發酵過程中占主導,消耗了大量的還原糖,并使乳酸菌的乳酸發酵受到了抑制。當SC與LF的接種比例為1∶4(體積比)時,發酵液中總酸度、還原糖殘糖量和產酸率分別為9.897 g/L、8.19 g/100 g和8.31%,可能是由于少量的酵母菌會通過促進乳酸菌的生長來加快乳酸發酵；進一步增加乳酸菌比例時,還原糖殘糖量有所提高,但總酸度和產酸率均下降,因此SC與LF在本次試驗中的最適接種比例為1∶4。

圖4 SC與LF接種比例對發酵液總酸度、pH和還原糖殘糖量的影響Fig.4 Effect of inoculation ratio of mixed SC and LF on the total acidity, pH and residual sugar content of reducing sugar in the fermentation broth

3.3.2 SC和LF接種比例對總酚含量和VC含量的影響

不同比例的SC和LF對發酵液總酚和VC含量的影響如圖5所示。發酵液中總酚和VC含量均隨LF接種比例的增加而增加,這是因為LF接種比例的增加加快了發酵液中有機酸的生成速率,有利于VC和游離酚的穩定。當SC和LF的接種比例由1∶4變為1∶6時,總酚含量由287.81 mg/L增長到288.67 mg/L,VC含量小幅下降,當SC與LF的接種比例達到1∶4后,LF接種比例的增加對總酚和VC的影響變小。

圖5 SC與LF接種比例對發酵液總酚和VC含量的影響Fig.5 Effect of the inoculation ratio of mixed SC and LF on the content of total phenol and VC in the fermentation broth

3.3.3 SC和LF接種比例對抗氧化能力的影響

不同比例的SC和LF對發酵液抗氧化能力的影響如圖6所示。發酵液的ABTS陽離子自由基清除率、DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率隨LF接種比例的增加而增加,因為在此條件下紅棗汁發酵液中的總酚和維生素含量均不斷升高,提高了發酵液的抗氧化能力。當SC和LF的接種比例為1∶4時,發酵液的ABTS陽離子自由基清除率、DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率分別為87.37%,89.41%和76.12%；而當SC和LF的接種比例由1∶4變為1∶6時,發酵液對各自由基的清除率上升幅度均小于1%。

再結合圖4和圖5,SC和LF的接種比例為1∶4時,發酵液的總酸度和復合菌株的產酸率有最大值且均大于單一LAB發酵的紅棗汁,分別為9.897 g/L和10.02%,總酚含量也有最大值,為287.81 mg/L。在此條件下進一步增加復合菌株中LF的比例時,對發酵液的總酸度、產酸率、總酚含量和抗氧化能力的影響均較小,因此本次復合菌株發酵紅棗汁的試驗中確定的SC和LF的最佳接種比例為1∶4。

圖6 SC與LF的接種比例對發酵液抗氧化能力的的影響Fig.6 Effect of the inoculation ratio of SC and LF inoculation on the antioxidant capacity in the fermentation broth

3.4 紅棗汁在SC和LF復合發酵過程中的成分分析

使用SC與LF比例為1∶4的復合菌株在37 ℃條件下發酵紅棗汁60 h,每隔12 h用高效液相色譜法測定發酵液中有機酸的含量。

3.4.1 紅棗汁發酵液在發酵過程中有機酸的變化

3.4.1.1 有機酸標品圖及其標準曲線方程

各種有機酸出峰順序如圖7所示,保留時間、標準曲線方程及相關系數見表2。

圖7 有機酸高效液相標品圖譜Fig.7 HPLC chromatograph of organic acids standards

表2 有機酸標準曲線方程Table 2 Standard curvilinear equation for organic acids

3.4.1.2 紅棗汁發酵過程中有機酸的動態變化

發酵過程中有機酸含量的變化如表3所示。在紅棗汁中檢測到6種有機酸,在發酵液中檢測到8種有機酸,表明草酸和乙酸由發酵產生。蘋果酸、酒石酸和琥珀酸的含量變化相對較小,表明蘋果酸、酒石酸和琥珀酸在發酵過程中穩定性相對較好[24]；乳酸、檸檬酸、乙酸和富馬酸含量由發酵前的1.081、0.077、0和0.083 g/L分別增加到發酵后的6.923、0.368、1.016和0.311 g/L。經發酵,這4種有機酸的含量顯著增加。發酵液中有機酸的變化也基本符合異型乳酸發酵的LAB在發酵過程中各類產物的生化反應機理[25]。

表3 發酵過程中紅棗汁發酵液有機酸的動態變化Table 3 Dynamic changes of organic acids in the jujube fermentation broth

3.4.2 紅棗汁發酵液在發酵前后氨基酸的變化

3.4.2.1 發酵前后紅棗汁中氨基酸含量的變化

發酵過程中氨基酸含量的變化如表4所示。在紅棗汁中共檢測到15種氨基酸,其中必需氨基酸有5種,分別為賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸,含量分別是3.47、12.73、10.13、17.02和47.58 mg/kg,氨基酸總量為471.29 mg/kg。在發酵液中共檢測到16種氨基酸,在發酵過程中產生了少量的異亮氨酸,總氨基酸含量為1 275.45 mg/kg,氨基酸含量在發酵前后有明顯變化,其中賴氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和脯氨酸這10種氨基酸含量經發酵后均有所增加,其原因可能是發酵過程中紅棗汁中的大分子蛋白質被LF和SC分解為氨基酸,以及在發酵后期LF和SC失活而被降解成氨基酸[26]；精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸這6種氨基酸含量均降低,其原因可能是在發酵過程中,這些氨基酸被轉化為風味物質。

3.4.2.2 發酵前后呈味氨基酸的變化

根據氨基酸的呈味,對發酵前后紅棗汁的氨基酸進行分析,結果如圖8所示。發酵液中鮮味氨基酸和甜味氨基酸含量分別由發酵前的134.93和264.53 mg/kg增長到發酵后的564.10和655.79 mg/kg,苦味氨基酸和芳香味氨基酸含量變化較小。表明經過LF和SC發酵,一定程度上改善了紅棗汁的口感。

表4 發酵前后紅棗汁中氨基酸含量的變化Table 4 Changes of amino acid content in the jujube juice before and after fermentation

圖8 發酵前后呈味氨基酸的變化Fig.8 Changes of delicious amino acids before and after fermentation

4 結論

本研究以紅棗汁為原料,確定了在37 ℃條件下,紅棗汁經SC和LF、LC、LB、LP復合發酵60 h時的最佳組合及接種比例為V(SC)∶V(LF)=1∶4。與單一LF發酵的紅棗汁相比,SC和LF復合發酵的紅棗汁中,總酸度由8.236 g/L提高到9.897 g/L,產酸率由7.03% 提高到8.31%,總酚含量由251.73 mg/L提高到287.81 mg/L,ABTS陽離子自由基清除率、DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率分別由78.73%、86.19%和72.57%提高到87.37%、89.38%和76.12%；與紅棗汁相比,發酵液中各類有機酸和氨基酸含量均有所提升,表明經過SC和LF發酵的紅棗汁品質得到了提高。