超聲波對不同鹽濃度下肌原纖維蛋白溶解性的影響

趙穎穎,李三影,田金鳳,扶磊,賈豐鮮,李可*,吳麗麗,白艷紅

1(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院,河南 鄭州,450001)2(河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室,河南 鄭州,450001)

雞胸肉,脂肪含量低,蛋白質含量高,與植物蛋白相比,雞肉蛋白具有較高的消化率(0.92)[1-2]。雞胸肉肌原纖維蛋白(myofibrillar protein, MP)是肌肉中主要的蛋白質,約占總蛋白含量的50%～60%[3],由于在高鹽溶液(0.48～0.67 mol/L NaCl)中易溶解,又被稱為鹽溶性蛋白[4]。過量攝入鈉會增加患高血壓和心血管等疾病風險。因此,如何降低加工肉制品中的鈉鹽含量對于人體健康尤為重要。

高強度超聲波作為一種綠色的食品物理加工技術,被認為是安全、無毒、環保的。低頻高強度超聲波(頻率16 k～100 kHz,超聲強度在10～100 W/cm2)可用于改變食品的物理或化學性質,廣泛應用于食品加工[5-6]。MARIANA等[7]報道了超聲波處理可以彌補肉糜中磷酸鹽含量降低帶來的缺陷。CHO和ITO等[8-10]研究報道了應用低頻(20 kHz)超聲波破壞肌原纖維結構是必不可少的前處理方法。超聲波處理能有效促進脊椎動物肌肉MP溶解,能使80%以上的MP在極低離子強度溶液中溶解。WANG等[11]研究了超聲波對高鹽濃度下雞肉肌原纖維蛋白結構和溶解度的影響,并觀察到超聲波處理對雞肉肌原纖維蛋白的表面疏水性,活性巰基和溶解度顯著增加。LIU等[12]探討了不同超聲波功率對MP在水中的溶解度和分散性的影響,結果發現,超聲波處理破壞和抑制肌絲組裝,增加了在MP水中的溶解性。

肉品加工中至少添加一定量鹽，探討超聲波處理時間和鹽濃度對MP理化性質的影響十分有必要。本試驗主要通過對不同NaCl濃度下雞胸肉MP進行不同時間的超聲波處理,測定MP的溶解度、濁度、粒徑、電位以及二級結構,分析超聲波時間對3種鹽濃度下MP溶解性的影響,為超聲波技術在低鹽肉品加工中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白羽雞雞胸肉,鄭州丹尼斯超市。剔除雞胸肉中結締組織及多余脂肪,用真空袋分裝,每袋200 g,儲存于-20 ℃,貯藏時間不超過2周。

NaCl、MgCl2、NaH2PO3、Na2HPO3等均為分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA),北京華邁科生物技術有限責任公司；十二烷基硫酸鈉,上海源葉生物有限公司；牛血清白蛋白(純度為98%),Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SZ-22A絞肉機,廣州旭眾食品機械有限公司；XHF-D高速分散器(內切式勻漿機),寧波新芝生物科技股份有限公司；AvantiJ-26S XPI大容量高速冷凍離心機,美國Beckman Coulter 公司；VCX-750超聲波細胞破碎儀,美國Sonic公司；TGL-20KR高速冷凍離心機,上海安亭科學儀器廠；TU-1810紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司；Nano-ZS90納米激光粒度儀,英國馬爾文儀器公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀,德國Bruker公司；PHSJ-3F pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;Lab-1-50冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MP的提取

參考ZHAO等[13]的方法提取。將雞胸肉提前12 h在4 ℃冰箱解凍,切成l～2 cm見方的小塊,3 000 r/min絞碎15 s,重復4次。在0～4 ℃條件下提取MP。均勻絞碎的雞胸肉∶分離緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4,0.1 mol/L NaCl,20 mmol/L MgCl2,10 mmol/L EDTA,pH 7.0)=1∶4 (g∶mL)比例均勻混合,6 000 r/min轉速下均質3次,每次30 s；混合物用20目篩網(孔徑0.9 mm)過濾后,2 000×g離心15 min,收集沉淀物質,重復2次,得到MP沉淀。將沉淀物按1∶4 (g∶mL)的比例均勻分散在0.1 mol/L NaCl溶液中,2 000 ×g離心15 min,重復2次,得到純化的MP。

1.3.2 低頻高強度超聲波處理

將上述提取的MP分別用含0.2、0.4、0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4,pH 7.0)稀釋至質量濃度為5 mg/mL的MP溶液,取70 mL溶液于100 mL燒杯中進行超聲波處理。13 mm的超聲波探頭放入MP溶液液面下25 mm處,超聲波參數為：頻率20 kHz,功率450 W,工作模式：超聲2 s,休息4 s,超聲波時間分別設定為0、3、6和9 min。利用冰水浴控制所有樣品最終溫度低于12 ℃。參考JAMBRAK等[14]的方法測定,超聲波強度為(30.26±2.73) W/cm2。

1.3.3 溶解度的測定

MP的溶解度參考ZHANG等[15]的方法進行測定。取10 mL離心管,加入5 mL處理后的MP,然后在4 ℃下以10 000 ×g離心20 min,用雙縮脲法測定蛋白質濃度。蛋白質的溶解度以離心后的上清液中的蛋白濃度表示。

1.3.4 濁度的測定

參考LI等[16]的方法，用相應鹽濃度的磷酸鹽緩沖液將超聲波處理后的各組MP樣品稀釋至1 mg/mL,在660 nm 處測定吸光度。參比溶液為相應鹽濃度的磷酸鹽緩沖液,平行測3次并取平均值。

1.3.5 Zeta電位的測定

參考張興等[17]的測定方法,取1 mL樣品于Zeta電位皿內,同時蓋兩邊的蓋子,保持左右液面等高,用激光粒度儀測試MP的電位。

1.3.6 平均粒徑及粒徑分布的測定

用相應鹽濃度的磷酸鹽緩沖液將超聲波處理后的MP樣品調整至質量濃度0.5 mg/mL,使用激光粒度儀測定樣品的粒徑,通過自帶軟件自動獲取粒徑,每個樣品重復3次。

1.3.7 肌原纖維蛋白二級結構的測定

參考LI等[18]的方法,稍加修改。測定MP的傅里葉變化紅外光譜以獲取MP二級結構信息。MP懸浮液在凍干機中干燥24 h,將凍干MP粉與干燥的KBr 以1∶150的質量比充分混合研磨,再用壓片機壓成1 mm厚的薄片。壓力為10 kPa,壓片時間1 min,然后在室溫下,用傅里葉變換紅外光譜儀對4 000～400 cm-1區域的所有光譜進行64次掃描分析。利用Peak Fit軟件提取1 700～1 600 cm-1區域的譜圖進行二階導數峰值擬合以獲得蛋白質二級結構的信息。

1.4 數理統計分析

使用Origin 8作圖,使用SPSS 20.0軟件的方差分析(ANOVA)用于溶解度、濁度、Zeta電位、粒徑數據分析,對不同處理組進行Duncan’s多重比較,P<0.05時認為存在顯著差異。對二級結構數據采用獨立樣本t檢驗分析,當P<0.05時判定2組(在同一鹽濃度下未超聲處理對照組與超聲9 min處理組)的平均值存在顯著差異。每次試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 溶解度測定

如圖1所示,在不同鹽濃度下,隨著超聲時間的增加,MP溶解度顯著增大(P<0.05)。當NaCl濃度為0.2 mol/L時,隨著超聲時間的延長,MP溶解度從0.12 mg/mL增加到1.41 mg/mL(P<0.05)。由圖1可知,超聲波處理時間為9 min、0.2 mol/L NaCl濃度下MP溶解度比0.4 mol/L NaCl下未超聲的溶解度高。SALEEM等[19]研究雞肌動球蛋白在0.1 mol/L NaCl中的溶解度也隨著超聲時間的延長而增加。這些結果說明,在不同NaCl濃度下,超聲波處理能夠實現MP的增溶。在相同超聲時間下,0.6 mol/L NaCl濃度下的MP與其他離子濃度(0.2、0.4 mol/L)相比,溶解度顯著增大(P<0.05)。主要是因為MP是鹽溶性蛋白,隨著鹽離子濃度(<0.8 mol/L)的增加,溶解度增大[20]。高強度超聲波處理能夠使蛋白質結構展開,使更多的親水性氨基酸處在外層,從而提高蛋白質的溶解性[21-22]。MP溶解度增加的原因可能是超聲空化作用產生的剪切力和沖擊力破壞了高度有序的絲狀肌球蛋白結構,降低了MP顆粒大小。由于MP顆粒尺寸的減小,MP顆粒比表面積的增加,可能會增加水-MP顆粒相互作用的能力,從而導致MP溶解性的增加[23]。

圖1 超聲波處理時間對不同鹽濃度下MP溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on MP solubility at different salt concentration注：字母不同表示不同樣品間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 濁度測定

超聲波處理時間對不同鹽濃度下MP濁度的影響見圖2。在相同NaCl濃度下,隨著超聲時間增加到3 min,不同離子濃度下的MP溶液的濁度顯著降低(P<0.05)。隨著超聲時間繼續增加,MP溶液的濁度值降低不顯著(P> 0.05)。結合圖2和表1可知,MP濁度與粒徑變化趨勢基本相同,這與SHANMMUGAM等[24]研究超聲波處理脫脂牛奶結果類似。由圖2可知,未經超聲波處理的0.2 mol/L NaCl濃度下MP溶液A660值明顯高于0.6 mol/L NaCl濃度下MP溶液的A660值。

圖2 超聲波處理時間對不同鹽濃度下MP濁度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on MP turbidity at different salt concentration注：大寫字母不同表示同一超聲時間、不同鹽濃度組之間差異顯著 (P<0.05)；小寫字母不同表示同一鹽離子濃度組、不同超聲時間差異顯著 (P<0.05)(下同)

表1 超聲波處理時間對不同鹽濃度下MP平均粒徑的影響Table 1 Effect of different time of ultrasonic treatment on the average particle size of MP at different salt levels

TANG等[25]研究超聲波處理低鹽濃度下羅非魚肌動球蛋白,其濁度的變化與本研究結果相同。不同離子濃度下的MP經過超聲波處理后,與未超聲波處理組相比,濁度顯著降低(P<0.05),表明高強度超聲波能夠通過“空化效應”破壞氫鍵和疏水相互作用,導致大的蛋白質聚集體破碎成小的蛋白質聚集體[26]。這些結果與MP溶解度增加相對應。

2.3 Zeta電位

如圖3所示,在相同超聲波處理時間下,較高的鹽濃度(0.6 mol/L NaCl)Zeta電位的絕對值較低。這可能是由于介質的離子強度增加,導致雙電層厚度減小[27]。WU等[28]報道在pH為7.5時,當NaCl濃度從0增加到0.8 mol/L時,豬肉MP的電位絕對值降低。隨著超聲波處理時間的增加,0.2 mol/L NaCl下MP的電位絕對值增加不顯著(P> 0.05),而0.4 mol/L NaCl下MP的電位絕對值顯著增加(P<0.05),電位值提升了44%,這可能是超聲波處理導致MP的展開,更多帶負電的氨基酸暴露到MP的表面,使蛋白質間的靜電斥力增強,很難發生聚集,從而增加了MP溶液體系的穩定性。

圖3 超聲波處理時間對不同鹽濃度下MP電位的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on MP potential at different salt concentration

2.4 平均粒徑及粒徑分布

蛋白質的粒徑是影響蛋白質功能特性的因素之一,也是蛋白質結構的宏觀表現[29]。由表1可知,超聲波處理后0.2、0.4、0.6 mol/L NaCl濃度下MP的平均粒徑分別從3 819、1 656、513.67 nm降低到1 656、438.50、253.10 nm(P<0.05),而隨著超聲時間的增加,MP的平均粒徑降低不顯著(P>0.05)。粒徑剛開始顯著降低可能是由于超聲提供的機械力使得MP之間的非共價鍵作用被打斷。隨著超聲時間的增加,平均粒徑變化相對緩慢,可能是因為已經打開的MP分子間的相互作用相對變弱[30]。李雨楓等[31]研究發現水洗提取的MP經過超聲波處理后,蛋白質的結構被破壞,表現為較小粒徑的分散顆粒。

由圖4所示,超聲波處理不僅減小了MP的粒徑,而且提高了粒徑分布的均勻性。所有樣品組均表現出2個峰。隨著超聲波處理時間的增加,粒徑分布圖出現的2個峰值向小的粒徑范圍移動,且峰值范圍變窄。表明超聲波處理能夠使MP溶液的粒徑降低,并縮小粒徑的分布范圍使其更集中,更均勻。

圖4 超聲波處理時間對不同鹽濃度下MP粒徑分布的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on MP particle size distribution at different salt concentrations

LIU等[32]研究表明超聲波處理0.5 mol/L NaCl濃度的鰱魚肌球蛋白,不僅減小了肌球蛋白聚集體的粒徑,而且提高了均勻度,與本研究結果一致。

2.5 MP二級結構

圖5 超聲波處理時間對不同鹽濃度下MP的FTIR光譜圖Fig.5 FTIR spectrum of ultrasonic treatment time for MP at different salt concentrations

圖6顯示了超聲波處理不同鹽離子濃度下MP的二級結構含量的變化。與未超聲樣品相比,超聲波處理9 min的樣品有序的二級結構減少,不同離子濃度下α-螺旋的含量分別降低了40%、33%和29%,β-折疊、β-轉角、無規卷曲的含量皆增加。ZHANG等[36]研究表明,α-螺旋結構通過肽鏈內部的氫鍵穩定,β-折疊結構由肽鏈間的氫鍵穩定。因此,α-螺旋含量降低表明,超聲處理使得部分分子內氫鍵斷裂,使蛋白有序結構被破壞,從而改變二級結構,使α-螺旋轉化為β-折疊、β-轉角和無規則卷曲,從而增加了MP的開放性和靈活性。張坤等[35]研究發現超聲波處理使α-螺旋降低、β-折疊增加,可能是因為超聲波的“空化效應”使α-螺旋肽鏈伸展變為線性的β-折疊,從而引起肌球蛋白結構發生變化,使得肌球蛋白與肌動蛋白結合作用發生變化,進而使肌動球蛋白的構象發生變化。

圖6 MP二級結構相對百分含量變化Fig.6 Relative content change of secondary structure in MP注：0.2-0和0.2-9表示：0.2 mol/L NaCl條件下超聲處理時間0 min 和 9 min;0.4-0和0.4-9表示：0.4 mol/L NaCl條件下超聲處理時間0 min 和 9 min;0.6-0和0.6-9表示：0.6 mol/L NaCl條件下超聲處理時間0 min 和 9 min

3 結論

低頻高強度超聲波(20 kHz,450 W,30 W/cm2)處理能夠有效改良不同鹽濃度下MP的理化性質與溶解性。與未超聲樣品相比,超聲波處理后MP溶液溶解度顯著上升(P<0.05)、濁度顯著下降(P<0.05)、粒徑顯著變小(P<0.05)、電位絕對值顯著增大(P<0.05)、二級結構呈現由有序結構(螺旋)向無序結構(折疊等)轉化的趨勢。這些結果表明超聲波處理促進了MP鏈展開,結構發生改變,使降鹽水平下MP溶液更加穩定,擁有更好的理化及溶解特性,可以在一定程度上彌補低鹽給肉制品帶來的缺陷。因此,該結果為超聲波技術在低鹽肉制品中的應用提供一定理論依據和技術指導。