基于核酸適配體識別-時間分辨熒光共振能量轉移檢測牛奶中培氟沙星獸藥殘留

宋亞寧,胡超瓊,霍秋宇,王力均,2,陳祥貴,2,黃玉坤,2*

1(西華大學 食品與生物工程學院,四川 成都,610039) 2(宜賓西華大學研究院,食品非熱加工重點實驗室,食品非熱加工工程技術研究中心,四川 宜賓,644004)

培氟沙星(pefloxacin,PEF)是一類人工合成的氟喹諾酮類抗生素,對陰性菌和陽性菌表現出抗菌活性[1],常應用于漁業、畜牧業等[2],當其含量超過閾值時,會對人體健康造成危害[1-3]。2015年9月,我國農業農村部發布公告停止食品動物中使用PEF、洛美沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥[4]。目前,針對PEF等氟喹諾酮類獸藥殘留的檢測方法主要有微生物法[5]、免疫分析法[6-8]、色譜法[9-10]、色譜-質譜聯用法[11-13]以及其他新型檢測方法等[14-17]。但這些方法存在靈敏度低、特異性差、設備昂貴、樣品預處理復雜且檢測費時、成本高等缺陷,不能較好地滿足現場快速檢測樣品的要求[18-19]。因此,建立高效、快速及可靠的檢測方法,不僅有利于減少檢測成本,也可滿足動物食品現場快速檢測的需求。

核酸適配體(aptamer,Apt)是通過指數富集篩選配體系統進化技術從人工構建的寡核苷酸文庫中篩選出來的一段對靶標物質有高親和力并能夠特異性識別的單鏈寡核苷酸序列[20-22],因其與抗體有相似之處,又稱“化學抗體”[23]。適配體可以特定的三維構象結合靶標而檢測目標物質[24],具有親和力高、特異性強、靶分子范圍廣、易于制備和修飾、穩定性好等顯著優點[25]。近年來,基于抗體抗原的酶聯免疫法檢測氟喹諾酮類獸藥殘留的方法多有報道,樊曉博等[26]制備了恩諾沙星抗體,建立了檢測多種畜禽產品中12種氟喹諾酮藥物的方法。CHEN等[27]建立了間接競爭性酶聯免疫分析法,可同時檢測動物可食組織中的24種喹諾酮類藥物。雖然,基于抗體的檢測具有特異性高、操作簡單、可同時處理多批樣品及實現快速檢測等多項優勢,但依然存在靶標的抗體難以制備、無法多次重復測定、對檢測操作環境要求高等問題[18]。Apt具有可體外合成、特異性高、專一性強等良好特性,可彌補基于抗原抗體的酶聯免疫法檢測靶標的缺陷。目前基于Apt檢測恩諾沙星[28-29]、氧氟沙星[30]報道較多,其他氟喹諾酮類獸藥的檢測報道較少[31]。此外，核酸適配體技術結合時間分辨熒光(time-resolved fluorescence,TRF)分析技術構建檢測體系，有利于消除樣品及環境中熒光物質對檢測的影響，進一步提高檢測的靈敏性[9,24]。

因此,基于Apt和TRF的優勢,即核酸適配體可特異性識別靶標PEF以及可體外合成、長期保存,TRF材料可消除樣品及環境中熒光物質對檢測結果影響。本文擬利用適配體生物識別PEF的特性,合成TRF納米材料NaYF4:Ce/Tb并構建時間分辨熒光共振能量轉移(time-resolved fluorescence resonance energy transfer,TR-FRET)模式,建立一種可應用于牛奶樣品中準確、高效并可完成1～2 h的PEF獸藥殘留檢測的新型熒光分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Y(NO3)3·6H2O、Ce(NO3)3·6H2O、Tb(NO3)3·5H2O、環丙沙星、達氟沙星、親和素、氨芐青霉素鈉鹽,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；O-磷酸乙醇胺(O-phosphorylethanolamine,AEP),梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；氯金酸、PEF、恩諾沙星,上海市阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇、戊二醛水溶液(體積分數25%)、NaCl等,國藥集團化學試劑有限公司(中國上海)；磺胺甲惡唑,華夏化學試劑有限公司；農業硫酸鏈霉素,石家莊通泰生化總廠；純牛奶,本地超市。

PEF適配體序列參考REINEMANN等[31]的報道,為5′-biotin-ATACCAGCTTATTCAATTAGTTGTGTATTGAGGTTTGATCTAGGCATAGTCAACAGAGCAC-GATCGATCTGGCTTGTTCTACAATCGTAATCAGTTAG-3′；PEF適配體及互補鏈(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

激光粒度儀(ZSN3600),英國馬爾文儀器有限公司；熒光光譜儀(FLUOROMAX-4CP),美國HORIBA公司；雙束紫外分光光度計(SDPTOP UV2800PC),上海舜宇恒平科學儀器有限公司；小型高速離心機(5424),德國Eppendorf股份公司；真空干燥箱(BZF-50),上海博訊實業有限公司；純水/超純水一體機(Direct-Q),美國Millipore公司；水熱合成反應釜(YH-50),上海越眾儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 適配體與靶標PEF分子對接分析

根據ZYKER[32]的方法,使用基于web服務器Mfold工具、3 dRNA工具、AutoDock軟件和Discovery Studio軟件進行分子對接分析,從而確定適配體互補鏈cDNA的序列。

1.3.2 制備NaYF4:Ce/Tb納米顆粒

參考TU等[33]方法合成NaYF4:Ce/Tb的納米材料。在圓底燒瓶中加入1.0 mmol AEP及一定化學計量比的NaCl、Y(NO3)3·6H2O、Ce(NO3)3·6H2O和Tb(NO3)3·5H2O,并與含有適量NH4F的乙二醇溶液溶解后老化30 min,轉移至高壓反應釜于180 ℃反應4 h,取出自然冷卻至室溫。洗滌后于60 ℃真空干燥箱干燥10 h,固體顆粒室溫避光封閉保存。

1.3.3 親和素修飾NaYF4:Ce/Tb納米顆粒的制備

利用經典戊二醛法偶聯親和素與NaYF4:Ce/Tb表面的氨基[34]。稱取一定量納米顆粒分散于磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)中與適量戊二醛水溶液反應,洗滌后加入一定量親和素于37 ℃連續過夜,反應后用PBS洗滌3次。最后重懸于PBS中,4 ℃保存備用。

1.3.4 組裝Apt-NaYF4:Ce/Tb納米顆粒

將定量的適配體加入親和素化納米顆粒懸浮液中,于37 ℃緩慢振蕩孵育3 h,反應結束后用PBS離心洗滌3次,重懸于PBS中,4 ℃保存備用。

1.3.5 制備納米金

將氯金酸溶液和超純水加入圓底燒瓶進行磁力攪拌煮沸,加入4 mL檸檬酸鈉。反應保持沸騰持續攪拌20 min,得到酒紅色溶液,冷卻后待用。

1.3.6 構建基于TR-FRET檢測PEF的方法

在檢測體系中,以一定濃度熒光探針檢測不同濃度的PEF溶液。在1 mL結合緩沖液(100 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L CaCl2,pH 7.6)中加入靶標PEF并與熒光檢測探針于21 ℃ 振搖孵育1 h,反應后測定溶液的TRF強度。設定測定條件為：激發波長252 nm,延遲時間0.1 ms,檢測時間1 ms。

1.3.7 基于TR-FRET檢測PEF測定牛奶樣品中PEF

將此檢測方法應用于實際食品樣品中PEF的定量檢測,并對此方法的分析性能進行探索。牛奶樣品處理具體步驟如下：將PEF標準品用純牛奶進行溶解,在室溫4 000×g離心20 min,去除牛奶樣品的上層脂肪層,將加標的牛奶樣品用結合緩沖液進行10倍稀釋,加以空白對照。

2 結果與分析

2.1 檢測原理

檢測PEF的原理如圖1所示。首先分別將能特異性識別PEF的適配體與NaYF4∶Ce/Tb連接、將cDNA與納米金連接獲取2種材料,后將這2種材料通過核酸序列互補雜交獲得檢測探針。檢測探針中的納米金與NaYF4∶Ce/Tb距離靠近時引起熒光共振能量轉移現象,導致檢測體系中熒光信號淬滅；加入靶標PEF時,靶標PEF會與cDNA競爭結合適配體,但適配體會優先與靶標PEF特異性結合,使得納米金與熒光材料脫離,引起檢測體系中熒光信號恢復,最終通過檢測時間分辨熒光強度與PEF濃度進行線性分析,測定靶標PEF的濃度。

圖1 基于核酸適配體識別-時間分辨熒光檢測PEF原理圖Fig.1 Schematic diagram of PEF based on aptamer recognition-TRPL detection

2.2 適配體與PEF分子對接分析

根據步驟1.3.1描述的工具模擬獲得PEF適配體的二級預測結構(圖2-a)。利用AutoDock、Discovery Studio軟件對適配體和PEF進行分子對接,其關鍵結合位點如圖2-b所示,主要集中在適配體的莖環及長莖區域(圖2-a紅框示意)。因此根據堿基互補配對原理,設計得到適配體互補鏈cDNA序列為5′-TTA CGA TTG TAG A-3′。

圖2 適配體二級結構預測圖(a)與適配體與PEF分子對接示意圖(b)Fig.2 Secondary structure prediction diagram of aptamer(a) and docking diagram of aptamer with PEF molecular(b)

2.3 納米材料及其表面功能化的表征

本實驗采用溶劑熱法,以AEP為表面活性劑和封端劑,在控制納米顆粒材料生長的同時,使納米顆粒材料表面氨基功能化,得到TRF納米顆粒材料NaYF4∶Ce/Tb。如圖3-a所示,該熒光材料的衰減時間為(8.96±0.09) ms。在252 nm波長紫外激發下,納米材料NaYF4∶Ce/Tb的熒光為綠色,NaYF4∶Ce/Tb的熒光光譜如圖3-b所示,在543、583和620 nm處有較強發射譜峰,最大發射波長為543 nm,因此本實驗選取發射波長543 nm處熒光作為檢測信號。本實驗采用透射電子顯微鏡、X射線衍射儀以及紫外分光光譜儀(UV-visible spectrophotometer,UV-vis)對熒光納米顆粒的形貌、晶型結構以及親和素修飾的完成度進行表征。由圖3-e可知,透射電鏡圖表明合成的熒光納米顆粒形貌基本呈球狀,分散均勻。利用X射線衍射技術對熒光納米顆粒結構進行分析,圖3-c得出采用溶劑熱法制備的熒光納米材料具有純立方相結構。由圖3-d可看出,NaYF4∶Ce/Tb在親和素修飾后280 nm處的吸收度較修飾前減弱,表明親和素修飾NaYF4∶Ce/Tb完成。

2.4 實驗條件優化

TRF納米材料與納米金因適配體與cDNA的互補配對而拉近,發生熒光共振能量轉移,導致熒光淬滅,加入靶標PEF后熒光恢復,從而完成PEF目標物質的檢測,因此,本實驗條件優化主要針對納米金與互補鏈比例以及適配體與互補鏈比例,結果如圖4-a所示。當cDNA∶納米金為150∶1時,NaYF4∶Ce/Tb的熒光強度在543 nm處的熒光減弱,淬滅效果最優且趨于穩定,因此選擇cDNA∶納米金最佳比例為150∶1。圖4-b表明,當cDNA加入量為140 pmol時熒光淬滅最強,選擇探針組裝最佳用量為140 pmol。但隨著cDNA濃度逐漸增大,熒光強度呈現先上升后又下降的趨勢,原因可能是反應體系后期受到納米金表面空間條件的限制,過量的cDNA會直接與適配體

a-時間分辨熒光材料壽命圖；b-時間分辨熒光光譜；c-X射線衍射圖；d-親和素功能化前后UV-Vis光譜圖；e-透射電鏡圖圖3 NaYF4∶Ce/Tb納米材料及功能化表征Fig.3 NaYF4∶Ce/Tb functionalized characterization

堿基互補配對結合而導致熒光強度又降低。

a-cDNA與納米金比例優化;b-適配體與互補鏈比例優化圖4 實驗條件優化Fig.4 Optimization of experimental conditions

2.5 特異性分析

基于適配體特異性結合靶標PEF的特點,選取PEF及其他6種抗生素(質量濃度均為1 mg/mL),包括磺胺甲惡唑、農用硫酸鏈霉素、氨芐青霉素鈉、環丙沙星、達氟沙星和恩諾沙星,離心取上清液測定其熒光強度,判斷建立的基于TRF結合納米金法檢測PEF的特異性。實驗結果如圖5所示,在相同濃度下,7種抗生素所引起的熒光強度的變化明顯不同,其中PEF的相對熒光強度遠高于磺胺甲惡唑、農用硫酸鏈霉素和氨芐青霉素鈉的強度。如果設定PEF響應值為100%,則PEF的同屬氟喹諾酮類獸藥環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星的相對熒光強度分別為PEF的9.73%、12.57%和12.71%,相較于PEF,環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星引起的熒光信號變化較小,基本可以忽略。實驗結果表明本方法選擇性良好,可應用于實際檢測。

圖5 本方法特異性分析Fig.5 Specificity analysis of the present detection

2.6 建立PEF檢測方法的工作曲線

在優化的最佳試驗條件下,將不同質量分數的PEF加入反應體系中,如圖6-a所示,隨著PEF添加量的增加,相對熒光強度逐漸增加。因此可利用PEF添加量與相對熒光強度進行線性回歸擬合,3倍信噪比法測得檢測限。如圖6-b所示,當ω(PEF)在0.2～20 μg/kg時,相對熒光強度與ω(PEF)正相關,其線性回歸方程為y=1 567.3x+3 956.3,相關系數為R2=0.974 2,檢測限為0.15 μg/kg。

a-PEF不同添加量體系的熒光強度;b-測定PEF的工作曲線圖6 建立檢測PEF的標準曲線Fig.6 Establishment of standard curve for detection of PEF

2.7 在純牛奶中的PEF檢測回收率

為驗證本方法在實際樣品中應用的準確性,將此法用于檢測牛奶樣品中的PEF。采用步驟1.3.7進行樣品預處理后,向牛奶樣品中分別加入1、5、15 μg/kg的PEF標準品液,每個添加量平行樣品測定3次。實驗結果如表2所示,PEF加標回收率在73.81%～99.86%,表明本法檢測牛奶中PEF準確性較好,可應用于實際樣品的測定。

表1 牛奶中PEF的加標回收測定結果Table 2 Recovery of PEF added in milk

2.8 與其他方法的比較

本方法構建的PEF檢測體系得到的PEF檢測限為0.15 μg/kg,線性范圍為0.2～20 μg/kg,測得牛奶中PEF殘留加標回收率為73.81%～99.86%。與表2中其他方法相比,本方法具有線性范圍較寬、檢測靈敏度較高的特點。同時,基于此研究基礎上,可以拓寬至建立多種靶標同時檢測的體系,達到現場低成本快速檢測的目標,可以更加有效地應用于食品中獸藥殘留檢測。

表2 常見檢測PEF的方法Table 2 Common methods for the detection of PEF

3 結論

本文采用溶劑熱法合成了氨基化的熒光納米顆粒(NaYF4∶Ce/Tb),利用靶標PEF與cDNA競爭結合適配體的原理,使得淬滅的熒光恢復達到檢測PEF的目的。在最優的實驗條件下,PEF的檢測線性范圍為0.2～20 μg/kg,相關系數R2為0.974 2。采用本方法對實際樣品牛奶中的PEF進行加標試驗,PEF的加標回收率在73.81%～99.86%,結果表明本方法準確度較高。另外,利用本方法檢測PEF時,從樣品制備至完成檢測共需1～2 h,所需檢測時間短,可用于實際樣品的檢測。本研究建立了基于分子親和識別的新型熒光發光檢測方法,該方法的準確度較高且成本低,但本研究還有需完善和發展的空間。由于適配體具有特異性且可體外合成,在檢測中可嘗試改變適配體來檢測多種靶標物質。本方法中利用的適配體與cDNA連接實現熒光淬滅原理可延伸到建立廣譜性的適配體探針,以此拓寬本方法檢測目標范圍,從而達到現場低成本快速檢測的目標,更好地應用于獸藥殘留的檢測。