單寧的血糖調節活性功能研究進展

耿雪營,郭藏,米生權,張艷貞,郭俊霞,陳文

(北京聯合大學 健康與環境學院,北京,100023)

單寧,又稱植物鞣質,是一種有鞣革性能的復雜混合物。單寧在植物界中廣泛存在,具有抗氧化、收斂、螯合等多種功能,在多領域均有應用,特別是在醫藥領域,抗腫瘤、降脂、降血糖等特性逐漸被發現,開發前景廣闊[1]。糖尿病作為慢性病之一,越來越多的人飽受其害,國際糖尿病聯盟(The International Diabetes Federation, IDF)公布的最新數據顯示：2019年大約有4.63億成年人(20～79歲)患有糖尿病,該病的醫療支出每年大于7 600億美元,其治療費用占成人平均每年總支出的10%[2]。對糖尿病患者的治療手段是控制血糖,減緩并發癥的發生；對非糖尿病人群分為兩種,一是預防糖尿病前期人群發展成糖尿病病人,二是避免血糖正常人群發展成糖尿病前期人群。這樣不僅可以減少醫療資源的占用率,還能降低疾病負擔,促進公眾健康,提高生活質量。非糖尿病病人調節血糖的方法主要是通過飲食、身體活動、服用具有血糖調節功能的生物活性物質等。

近些年單寧在工業領域的研究廣泛,比如利用其吸附性能凈化水質[3],利用其抗菌性延長食品保存[4]等。在醫藥領域,單寧抗癌抗腫瘤的研究比較多,且不斷有新的進展[5],但關于其降血糖作用的綜述較匱乏,因此本文綜述了國內外單寧調節血糖的相關實驗及進展。

1 單寧簡介

單寧存在于某些植物的干、皮、根、莖、葉、果實及果殼中,味澀略酸,可溶于水、乙醇、丙酮等,分子質量約為500～3 000 Da,分子結構見圖1[6]。單寧中存在大量酚羥基,化學結構中含有數個酚羥基的苯核,因此活性較強,按照結構不同可以分為水解單寧、縮合單寧和復合單寧三大類,水解單寧又包括棓單寧和鞣花單寧,含有酯鍵,在強酸、強堿或某些酶的作用下可水解生成酸類和醇類；縮合單寧又稱原花青素,核心結構是黃烷醇,不易水解；因復合單寧的結構中含有酯鍵和黃烷醇,被認為是前兩類的復合物[7-8]。根據單寧加熱到180～200 ℃時所得的產物可分為(1)沒食類單寧,加熱所得產物中含焦棓酸(焦性沒食子酸),大部分水解類單寧具有焦棓酸類的特性,如橡椀、栗木等所含的單寧；(2)兒茶類單寧,加熱所得產物中含焦兒茶酚,大部分縮合類單寧具有焦兒茶酚的特性,如堅木、栲樹皮等所含的單寧。

a-水解單寧;b-縮合單寧圖1 水解單寧和縮合單寧的化學結構Fig.1 Chemical structures of hydrolysable tannin and condensed tannin

2 植物單寧的提取與制備

植物單寧的提取方法有很多,常見的有浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界CO2萃取法和酶轉化提取法,對于不同的植物,其最佳提取率參數條件也不同。浸提法利用有機溶劑溶解單寧,成本低,適合工業生產,是最常使用的提取技術；微波輔助提取法的原理是使細胞熱膨脹破裂,主要用于實驗室樣品預處理；超聲波輔助提取法通過破壞細胞壁提高單寧提取率,和超臨界CO2萃取法一并得到醫藥、食品領域的青睞；從目前研究看,酶轉化法耗時長,產率低,實際應用還需研究[9]。另外還有超高壓提取法、膜技術提取法、半仿生提取法、發酵法等提取方法,均可以大大提高單寧提取率,但同時存在不足之處,如發酵法耗時長等[10]。通常提取到的單寧是粗單寧,可以通過活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法、膜分離法等進行純化,活性炭吸附法成本低,但純化能力有限；大孔樹脂吸附及膜分離法使用較多,但大孔樹脂吸附仍需再生處理；而采用膜分離法得到的單寧純化效率及品質較高[11]。

單寧具有抗氧化、收斂、螯合、抑菌、除垢等多種作用,可用作鞣革、墨水制造、紙張、絲綢、鍋爐除垢、媒染劑、啤酒和葡萄酒的澄明劑、橡膠的凝結劑等,在食品、日化、水、農業、傳統工業等領域得到了有效且廣泛的應用[12]。同時,單寧也擁有多種生物學活性,對于葡萄糖代謝及血糖調節具有重要作用。

3 單寧的調節血糖作用

單寧對血糖的調節作用在細胞水平、動物水平都有研究,以脂肪細胞、小鼠、大鼠、幼豬為實驗對象,結果表明單寧可以降低血糖含量。

有研究者用3T3-L1細胞證明單寧可以促進葡萄糖轉運[13],其葡萄糖攝取實驗結果顯示,添加去除單寧的大花紫薇提取物的3T3-L1細胞對葡萄糖的吸收量與對照組細胞無顯著差異,但與添加大花紫薇提取物組的吸收量相比顯著下降,另外添加20 mg/L單寧酸的3T3-L1細胞的葡萄糖攝取量顯著高于對照組,并且與添加大花紫薇提取物組的吸收量無顯著差異,同等作用時間下,多項對比說明單寧的存在加速了3T3-L1細胞對葡萄糖的攝取。此外,隨著胰島素作用濃度的增大,細胞對葡萄糖的攝取量呈先增加后減少的趨勢,而單寧對葡萄糖攝取量的影響和胰島素相似,在單寧質量濃度為40 mg/L時,葡萄糖攝取量達到頂峰,說明高濃度的單寧不一定促進葡萄糖的吸收,單寧劑量需適當。這與另一學者的研究結果有對應之處,幼豬在食用含單寧的高粱經一段時間后,高單寧含量組動物血液中的葡萄糖含量低于低含量單寧組,表示與單寧含量高的高粱品種相比,幼豬對單寧含量低的高粱品種的利用率更高[14]。TEIXEIRA等[15]也發現含單寧的高粱可以降低成年犬攝入食物的能量利用率。

魏海峰等[16]、曲萌等[17]采用鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,探究單寧的作用,實驗結果顯示,單寧顯著降低糖尿病大鼠的血糖水平,改善其腎臟功能和形態學異常,這可能與抑制腎臟多(二磷酸腺苷-核糖)多聚酶的表達有關。另有研究發現一種摩洛哥菊科植物的鞣質、聚果榕單寧均可以降低糖尿病大鼠的高血糖水平,改善肝臟、胰腺病變,提高心臟和腎臟的SOD水平,提高心臟、腎臟、肝臟的過氧化氫酶水平[18-19]。

虎杖是一種具有活血止痛功效的中藥,臨床應用廣泛。實驗發現虎杖鞣質經浸提純化后,灌胃給四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠,其空腹血糖含量降至6.85 mmol/L,表明虎杖鞣質具有降血糖作用[20]。采用溶液浸提和超聲波輔助提取油茶果殼中的鞣質,以400 mg/kg的劑量連續灌胃糖尿病小鼠8 d后,該組小鼠的空腹血糖水平顯著低于模型組小鼠[21]。

基于上述研究可以看到,單寧具有降低血糖的作用,并且還會影響食物利用率[22-23]、緩解器官組織病變[24]、提高機體抗氧化水平等[25]。

4 單寧的血糖調節機制

根據糖的來源和去路,單寧對血糖的調節可分為兩個部分。一部分調節是在食物被分解成葡萄糖前,抑制食物分解成葡萄糖的速度,比如抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性；另一部分調節是在食物被分解成葡萄糖后,加速葡萄糖的攝取、儲存,抑制葡萄糖的生成。后者又可以分為胰島素作用和糖代謝兩個部分,比如促進胰島素信號分子的表達,調節糖代謝過程中酶的表達等。

4.1 單寧抑制食物分解及吸收率

4.1.1 抑制α-葡萄糖苷酶的活性

α-葡萄糖苷酶是分解碳水化合物最后一步的關鍵酶,抑制α-葡萄糖苷酶的活性就可以延緩碳水化合物的釋放,降低機體血糖值[26],因此,α-葡萄糖苷酶被認為是糖尿病候選藥物的重要靶標[27]。實驗顯示單寧是良好的α-葡萄糖苷酶抑制劑[18]。

體外實驗顯示,葡萄籽提取物(主要成分是縮合單寧)可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性。CHEN等[29]用4-硝基苯基-a-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG)作為底物,與α-葡萄糖苷酶、葡萄籽提取物作用15 min后,于405 nm波長處測量吸光值,結果顯示普通提取法和微波萃取法得到的提取物都可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性,并且與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制性無顯著差異。疏花衛矛中分離的縮合單寧抑制α-葡萄糖苷酶的活性水平(IC50值約為0.083 μg/mL)遠高于阿卡波糖(IC50值約為1 345 μg/mL),并且老鼠經口服可以顯著降低體內血糖含量,提示縮合單寧有良好的降血糖作用[30]。生物活性分析顯示,香榧仁提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力(IC50=0.14 mg/mL)高于陽性對照品阿卡波糖(IC50=1.29 mg/mL),發揮抑制性的物質主要是黃酮和縮合單寧[31]。蓮蓬殼提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制能力(IC50=15.18 μg/mL)遠高于阿卡波糖(IC50=1 290 μg/mL),而縮合單寧也是蓮蓬殼提取物中發揮抑制作用的成分之一[32]。

夏櫟[33]、歐洲栗[34]、堅木[35]中的單寧粗提物都表現出良好地抑制α-葡萄糖苷酶的活性,堅木單寧洗脫分離出的2種組分的抑制力是阿卡波糖的10倍以上,經鑒定包括水解單寧、縮合單寧、沒食子酸及其他物質,在夏櫟中分析得到發揮作用的主要成分是栗木鞣花素。單寧對α-葡萄糖苷酶的抑制機理還未明確,像水蒿根中的提取物[36]、齊墩果酸和熊果酸[37]、2,4-二羥基-5-甲基苯乙酮3[38]的衍生物等是通過與α-葡萄糖苷酶結合,改變了α-葡萄糖苷酶的二級結構,進而抑制α-葡萄糖苷酶活性,而柿單寧[39]能改變α-葡萄糖苷酶的α-螺旋、β-折疊、β-反折疊含量,因此,單寧是通過與α-葡萄糖苷酶結合影響酶結構從而達到抑制性。

α-葡萄糖苷酶抑制劑在治療糖尿病領域已經得到臨床應用,如伏格列波糖、阿卡波糖,但由于其伴有胃腸道副作用,因而具有局限性。開發天然來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑是今后的研究熱點[40],而具有抑制活性的單寧在該領域有很大的應用前景。

4.1.2 抑制α-淀粉酶的活性

在早年的研究中,皮馬印第安人傳統主食包括玉米、青豆、黃白皮、牧豆樹和橡子,外國學者發現食用這些食物后的志愿者體內血糖指數(glycemic index,GI)均較低,這些食物的淀粉消化率比面包低得多,其中橡子的淀粉消化率最低[41],推測是橡子中的單寧減緩淀粉的消化率,使得GI較低,這對后來單寧降低血糖機制的研究提供了參考。近年來有實驗表明柿單寧可以降低淀粉的酶解率,其抑制作用隨著直鏈淀粉含量的增加而增強,并且等量的柿單寧對低、中、高含量直鏈淀粉引起血糖升高的抑制作用越來越強,說明柿單寧還通過抑制直鏈淀粉分解來降低淀粉消化率,從而延緩血糖值的升高[39]。

α-淀粉酶是機體吸收碳水化合物的關鍵酶,研究發現單寧可以抑制其活性,達到降低血糖的目的。甲醇溶液提取柿單寧后烘干制成粉末加入反應體系,通過測量可溶性淀粉中低聚糖的釋放率,分析柿單寧是否能抑制α-淀粉酶的活性,結果顯示,柿單寧能抑制α-淀粉酶的活性且呈劑量依賴性,適宜pH為5～8.5,另外在同等用量下,柿單寧抑制α-淀粉酶的活性(IC50=1.70 g/mL)遠高于五倍子酸、兒茶素[42]。堅木單寧也可以抑制α-淀粉酶的活性[28],但有實驗表示相同濃度的虎杖單寧可以抑制α-D-葡萄糖苷酶、蔗糖酶等的活性,并不會抑制α-淀粉酶的活性,極高濃度的虎杖單寧對α-淀粉酶的影響也微乎其微[43]。兩者實驗結果是不同的,推測不同原材料的單寧提取物中的單寧含量差異大,或者單寧種類不同,對α-淀粉酶的影響不同。

單寧抑制α-淀粉酶活性的作用機制可能是與α-淀粉酶發生相互作用,改變α-淀粉酶的結構。紅外光譜分析,柿單寧的存在可以增加α-淀粉酶中的α-螺旋含量,降低β-轉角含量[39],這與單寧對α-葡萄糖苷酶的作用相似。因此,單寧作為良好的α-淀粉酶抑制劑,可以有效控制血糖,通過延緩碳水化合物的吸收調節血糖水平。

4.2 單寧對胰島素信號分子的調節

4.2.1 促進葡萄糖轉運蛋白4的表達

胰島素分泌不足或胰島素抵抗是引起糖尿病的主要病因,激素是血糖調節的重要途徑,胰島素是降低血糖的唯一激素。LIU等[13]研究顯示,單寧對胰島素受體缺陷細胞的葡萄糖攝入量沒有影響,會通過胰島素的介導刺激葡萄糖轉運。葡萄糖轉化成糖原儲存是血糖水平降低的途徑之一,葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)是胰島素介導的肌糖原轉化過程中的重要蛋白,也是維持機體血糖穩態的重要因子[44]。在乙醇造成的大鼠骨骼肌細胞胰島素抵抗中,GLUT4受到下調[45]。在脂肪細胞中添加GLUT4的阻斷劑細胞松弛素,發現單寧+阻斷劑組的葡萄糖攝取量比單寧組的葡萄糖攝取量顯著下降,經免疫染色觀察,發現未添加阻斷劑組細胞周圍的GLUT4含量明顯高于含阻斷劑組[13]。由此可見,單寧可以通過提高GLUT4的水平增加脂肪細胞的葡萄糖攝取量,進而調節血糖水平。

在胰島素向GLUT4傳遞信號的過程中,涉及到胰島素受體底物蛋白-1(insulin receptor substrate,IRS-1)、磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)、Akt、aPKC(atypical PKC,非典型蛋白激酶C)等蛋白[44]。Western-blot也顯示單寧處理3T3-L1細胞后,胰島素受體和Akt磷酸化增加[13]。另外在沒食子酸緩解高果糖飲食誘發的大鼠胰島素抵抗中,大鼠肝臟內的胰島素受體(insulin receptor,IR)、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、GLUT2含量均增加[46]。這為單寧調節血糖的分子水平研究提供了方向。

4.2.2 促進酪氨酸蛋白磷酸化水平

酪氨酸激酶既可以作為胰島素受體,又可以作為酶發揮作用。在探究單寧對葡萄糖攝取量影響的實驗中,加入酪氨酸激酶抑制劑后,葡萄糖攝入量減少,說明酪氨酸激酶抑制劑影響了單寧的活性,提示酪氨酸激酶參與了單寧對血糖的調節。酪氨酸磷酸酶與酪氨酸激酶共同調節酪氨酸蛋白磷酸化水平,蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase-1B,PTP1B)是酪氨酸磷酸酶家族成員之一,對胰島素信號轉導進行負調節,是近年來抗糖尿病藥物研發的重要機制之一[47]。MUTHUSAMY等[48]證實了菊苣中的單寧是通過抑制PTP1B的活性促進3T3-L1細胞對葡萄糖的攝取,另外土肉桂的嫩枝粗提物具有抗高血糖的活性,用不同溶劑從其中分別萃取出4種物質,正己烷萃取得到的原花青素含量最高為561.1 mg/g,對PTP1B的抑制力最強,高于對照組烏索酸[49],說明單寧可能抑制PTP1B活性來降低血糖水平。

5 展望

從已有研究看,單寧在細胞、動物水平具有明確的降低血糖的作用,但在分子水平上研究不足,尤其是胰島素信號分子、糖代謝方向及其分子機制還有很大的探究空間。目前報道的單寧調節血糖的途徑并不是單一的,主要有3個調節機制：抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性,影響食物中碳水化合物分解,延緩碳水化合物的吸收率；促進GLUT4的表達,提高體內葡萄糖轉運能力,改善胰島素抵抗；激活酪氨酸激酶活性,影響酪氨酸蛋白磷酸化水平,促進細胞對葡萄糖攝取能力。除此以外,葡萄糖在機體內的代謝也會影響血糖水平,如糖酵解、糖異生、糖原的合成與分解,干預糖異生和糖原分解的過程均可以延緩機體血糖水平的升高,但單寧對糖酵解、糖異生途徑的影響研究較為有限。HUANG等[46]實驗發現沒食子酸可以促進胰島素抵抗小鼠肝臟中糖酵解限速酶己糖激酶和磷酸果糖激酶、糖原合成酶的表達,抑制肝臟糖異生過程中1,6-二磷酸果糖激酶的表達,單寧同樣具有降低血糖的作用,對糖異生、糖酵解可能也有影響,這也是接下來研究的方向之一。此外,單寧是抗營養因子[50],具有較強的胃腸副作用,在調節血糖同時還具有抑制酶活性等功能,導致機體不適,因此需明確合適的劑量范圍,使單寧在調節血糖的同時不會對機體造成損傷。