響應面法優化巴氏醋桿菌的耐酸醇營養鹽培養

嚴子云， 陳 雄， 李 欣

(發酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業發酵協同創新中心，湖北省工業微生物重點實驗室，湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068)

國內白醋生產多采用液態深層發酵法[1]。該工藝有培養基成分簡單(乙醇、營養鹽和水)，發酵周期短，醇酸轉化率高，產酸率高等優點[2]。該工藝中，營養鹽的組分非常關鍵。營養鹽中含有醋酸菌生長所必需的生長因子，其品質高低直接影響到醋酸菌的發酵產酸水平和醋酸品質[3-5]。但現階段中國市場上使用最廣泛的醋酸菌培養基是進口的弗林斯醋酸菌發酵營養鹽，國產營養鹽與之相比還是存在著微弱的不足[6]。

醋酸菌是一種特殊的微生物[7]，在醋酸發酵開始前就需要添加高濃度的初始乙醇，所以提高醋酸菌的乙醇耐受性對于工業生產時提高乙酸的產量至關重要[8-9]。醋酸菌的生長速率很大程度上取決于乙醇濃度[10-11]，乙醇濃度過高會產生抑制作用，醋酸菌的生長速度會減緩，生長周期也會延長[12-13]。發酵過程中乙酸積累過多，會對醋酸菌產生毒性作用，嚴重影響發酵的結果[14-15]。醋酸發酵過程中，培養基中的自由氨基酸是醋酸菌很好的氮源[16-17]。研究發現，氨基酸對處于惡劣環境下的細胞生長和存活起著至關重要的作用[18-19]。目前關于氨基酸對醋酸菌的影響的研究僅僅停留在生物量和產酸率上，而且是進行的單一氨基酸的實驗，沒有進行多因素的復配實驗，對于耐受性的研究更是寥寥無幾。

基于以上分析，筆者采用響應面法優化營養鹽培養基, 確定最佳微量元素的最適添加量, 使巴氏醋桿菌在乙醇脅迫和乙酸脅迫條件下的生物量和產酸量得到較大的提高。

1 材料與方法

1.1 菌株和原料

巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)由功能酵母與釀造微生物實驗室保藏; 營養鹽AC001，由安琪酵母公司提供。

1.2 培養基

富集培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH自然，115℃滅菌20 min; 種子培養基：葡萄糖10 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH自然，115℃滅菌20 min; 初始發酵培養基：營養鹽2.0 g/L，精氨酸0.10 g/L，賴氨酸0.10 g/L，胞嘧啶0.10 g/L，谷氨酰胺0.10 g/L，葉酸0.10 g/L，pH自然，115℃滅菌20 min。

1.3 菌種活化及培養方法

將平板保藏的巴氏醋桿菌單菌落勾一環接種到50 mL的液體富集培養基，于32℃、200 r/min的恒溫培養振蕩器中培養24 h，活化得到一級種子。再按10%的接種量將一級種子液接種至50 mL液體種子培養基，32℃、200 r/min活化48 h，得到二級種子。將二級種子按5%的接種量接種到液體營養鹽培養基，置于32℃、200 r/min恒溫培養振蕩器進行搖瓶發酵。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量的測定取發酵液2 mL，23℃、8000 r/min離心10 min，棄去上清，加入2 mL去離子水重懸菌體。以去離子水為對照，在紫外可見光分光光度計600 nm處進行比色測定。

1.4.2 總酸的測定取1 mL巴氏醋桿菌發酵液于100 mL錐形瓶中，加入1滴0.05%酚酞作指示劑，將標定的0.05 mol/L NaOH溶液加入堿式滴定管中，然后滴定樣品至淡粉色，30 s內顏色不褪去，即達到滴定終點，總酸量計算公式如下：

式中：V為發酵液樣品滴定所消耗的NaOH溶液的體積，mL；V0為以空白培養基為對照滴定所消耗NaOH溶液的體積，mL；CNaOH為NaOH溶液的濃度，mol/L；V樣為樣品的體積(mL)，60為醋酸的分子質量(g/mol)。

1.4.3 乙醇的測定乙醇標樣配置：吸取50 μL無水乙醇到100 mL容量瓶中，加入去離子水準確定容至100 mL。

待測樣品處理：取1 mL發酵液加入4 mL去離子水中稀釋5倍，然后取0.25 mL稀釋后的樣品加入4.75 mL去離子水中稀釋至20倍。生物傳感儀定標后，便可進樣品測定乙醇含量。

1.4.4 巴氏醋桿菌半抑制濃度IC50的測定配置0.2%營養鹽培養基2000 mL，按照0、3%、6%、9%、12%、15%的乙醇濃度梯度和0、1%、2%、3%、4%、5%的乙酸濃度梯度配置成50 mL的發酵培養基，取二級種子液5 mL接入50 mL培養基中，置于32℃、200 r/min恒溫培養振蕩器進行搖瓶發酵，取樣時間點為0、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，分光光度計測出生物量。以0乙醇濃度和乙酸濃度的培養基作為空白對照組，比較其結果得出結論，確定乙醇IC50和乙酸IC50的濃度以及取樣時間點。

1.4.5Plackett-Burman(PB)實驗設計Plackett-Burman實驗設計是一種多因素兩水平的實驗設計方案，能以最少的實驗次數篩選出響應值影響最顯著的變量。利用Design-Expert把每個因素設計成高(+1)、低(-1)2個水平，高水平為低水平的2倍，以巴氏醋桿菌的生物量作為響應值進行隨機組合實驗，用Expert 8.0.6對實驗結果進行顯著性分析。

1.4.6 最陡爬坡實驗設計根據PB實驗篩選出來的3個對巴氏醋桿菌生物量影響顯著的因素及其正負效應，在合適的范圍內取值設計最陡爬坡試驗，以快速逼近最大響應區域。

1.4.7 響應面分析實驗設計根據最陡爬坡試驗確定的中心點，利用Design-Expert進行中心組合的實驗設計，將最陡爬坡試驗中的3個顯著因素分別標記為X1、X2、X3，以發酵培養60 h后巴氏醋桿菌的生物量作為響應值，標記為Y。將3個顯著因素分為5個不同水平，0對應對響應面中心點，1和-1分別對應高水平和低水平，1.68和-1.68對應更高值和更低值。以這5個不同水平進行隨機組合實驗，用Expert 8.0.6對實驗結果進行響應面分析。

1.4.8 數據處理所有試驗數據為至少三個平行試驗的平均值，采用Origin 9.0和Expert 8.0.6對試驗進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 巴氏醋桿菌生長半抑制濃度IC50的確定

半抑制濃度指微生物在脅迫條件下與非脅迫條件下生物量之比等于50%時所對應的濃度，IC50值可以反映巴氏醋桿菌對乙酸或乙醇的耐受程度。

2.1.1 乙醇IC50的確定乙醇含量為0的對照組培養基中，巴氏醋桿菌在穩定期時的最大生物量為0.45 g/L，3%乙醇濃度對巴氏醋桿菌的生長有很明顯的促進作用，在乙醇消耗完后進入穩定期，最大生物量為0.65 g/L。6%乙醇濃度在巴氏醋桿菌生長前期有微弱的抑制作用，在對照組進入穩定期之后，有緩慢生長的趨勢，發酵終點最大生物量為0.48 g/L。9%乙醇濃度對巴氏醋桿菌有明顯的抑制作用，在48 h進入穩定期時的生物量為0.25 g/L，約為對照組的一半。12%乙醇濃度的實驗組在48 h的生物量為0.15 g/L，在60 h后有緩慢生長的趨勢，但過于延長了巴氏醋桿菌的生長周期。乙醇濃度為15%時，巴氏醋桿菌會停止生長甚至凋亡。因此確定乙醇IC50的體積分數為9%，取樣時間點為48 h，后續實驗均加入9%乙醇。

圖 1 巴氏醋桿菌乙醇耐受IC50的確定

2.1.2 乙酸IC50的確定1%乙酸體積分數前期會抑制巴氏醋桿菌的生長，但在24 ～48 h之間巴氏醋桿菌有明顯的生長跡象，在60 h的生物量為0.23 g/L，約為對照組生物量的一半，乙酸體積分數大于1%時對巴氏醋桿菌的生長有明顯抑制作用，甚至導致凋亡。因此確定乙酸IC50的體積分數為1%，取樣時間點為60 h，后續實驗均加入體積分數為1%的乙酸。

圖 2 巴氏醋桿菌乙酸耐受IC50的確定

2.2 營養鹽濃度優化

營養鹽中含有巴氏醋桿菌生長所必需的碳源、氮源、鹽類和生長因子，因此營養鹽的添加濃度會直接影響到巴氏醋桿菌的生長水平和產酸水平。本實驗用營養鹽培養基代替傳統葡萄糖、酵母浸粉培養基。濃度過低，不能滿足巴氏醋桿菌的生長需求；濃度過高，則會增加生產的成本或者造成不必要的浪費。分別以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%營養鹽配置培養基，微量元素的添加量不變，115℃滅菌20 min后加入9%乙醇和1%乙酸。32℃、200 r/min搖床培養60 h，取樣測定生物量和總酸含量(圖3)。

圖 3 營養鹽濃度對巴氏醋桿菌在醇酸脅迫下的影響

營養鹽濃度的增加對巴氏醋桿菌在醇酸脅迫下生長的影響較小，在1.0～4.0 g/L的濃度區間，隨著濃度的加大，生物量和醋酸產量隨之增加，在4.0 g/L濃度營養鹽培養基中生物量最大為0.38 g/L。繼續增大濃度發現，生物量和醋酸產量幾乎保持不變，說明4.0 g/L濃度的營養鹽已經能夠滿足巴氏醋桿菌的生長需求。因此選擇4.0 g/L的營養鹽濃度作為最佳濃度。

2.3 微量元素濃度的優化

本實驗對精氨酸、賴氨酸、胞嘧啶、谷氨酰胺、葉酸這5個單因素進行優化，其添加量初步定為氨基酸0.50 g/L、嘧啶0.50 g/L、維生素0.10 g/L，復配時添加量均為0.10 g/L。32℃、200 r/min搖床培養60 h，取樣測定生物量和總酸含量，選取促生長作用最明顯，產酸量最高的添加量，其對巴氏醋桿菌生長和產酸的影響分別如圖4所示。

(a)精氨酸

由圖4a可知，精氨酸的添加對巴氏醋桿菌產酸能力無明顯影響，但對巴氏醋桿菌的生長影響較大。添加量為0.10 g/L時，其生物量最大達到0.33 g/L，總酸量為16 g/L。隨著添加量的增加，生物量反而減少，在0.30～0.60 g/L范圍內，生物量基本保持在0.20 g/L左右不變。添加量增加至0.70 g/L時，生物量又開始增加，并在0.80 g/L濃度時生長到0.31 g/L左右。說明精氨酸的添加量并不是越大促生長作用就越明顯，反而在0.30～0.60 g/L范圍內時，有微弱的抑制作用，因此選擇0.10 g/L的精氨酸濃度作為最佳濃度。

由圖4b可知，賴氨酸濃度對巴氏醋桿菌生長和產酸的影響呈現出峰型分布趨勢，在0.10～0.40 g/L時，隨著賴氨酸濃度的增大其生物量和總酸量也隨之增大，但是隨著添加量的繼續增大生物量和總酸卻開始逐步下降。賴氨酸濃度在0.40 g/L時生物量最大為0.36 g/L，產酸量最大為16.3 g/L。因此選擇0.40 g/L的賴氨酸濃度作為最佳濃度。

由圖4c可知，胞嘧啶濃度在0.10～0.30 g/L之間時，巴氏醋桿菌的生物量在隨著濃度的增大而減少，產酸量有少量增加。繼續增大濃度后，生物量呈現出上升趨勢，并在0.70 g/L時生物量達到最大為0.35 g/L，總酸也達到最大的16 g/L。在胞嘧啶濃度為0.80 g/L時，對生長有明顯的抑制作用，產酸量也隨之減少。因此選擇0.70 g/L的胞嘧啶濃度作為最佳濃度。

由圖4d可知，谷氨酰胺濃度為0.20 g/L時，生物量和總酸量達到最大為0.36 g/L和17 g/L。由圖7可知，谷氨酰胺的添加對巴氏醋桿菌在脅迫條件下的促生長效果并不佳，但其對于巴氏醋桿菌產酸能力的影響較為顯著，因此選擇0.20 g/L的谷氨酰胺濃度作為最佳濃度。

由圖4e可知，葉酸濃度對巴氏醋桿菌生長的影響呈現峰型分布趨勢，隨著葉酸濃度從0.06 g/L增加到0.14 g/L，生物量也隨之增加，并在0.14 g/L時達到最大0.37 g/L，繼續增大濃度后，生物量又逐漸減少。其對巴氏醋桿菌產酸量的影響在0.06 g/L到0.10 g/L之間隨著濃度增加而減少，在0.10 g/L到0.14 g/L又增加，在0.14 g/L時最大產酸量為16.4 g/L，在0.16 g/L到0.20 g/L之間，產酸量維持在15.8 g/L左右。因此選擇0.14 g/L的葉酸濃度作為最佳濃度。

綜合考慮生物量水平和產酸水平，整合所有單因素濃度的優化結果，得到巴氏醋桿菌的初優培養基為4.0 g/L營養鹽、0.10 g/L精氨酸、0.40 g/L賴氨酸、0.70 g/L胞嘧啶、0.20 g/L谷氨酰胺和0.14 g/L葉酸。在此基礎上通過后續的PB實驗和響應面實驗對培養基進行進一步的優化。

2.4 Plackett-Burman實驗結果

本次Plackett-Burman實驗選擇了4.0 g/L營養鹽、0.10 g/L精氨酸、0.40 g/L賴氨酸、0.70 g/L胞嘧啶、0.20 g/L谷氨酰胺和0.14 g/L葉酸作為實驗的高水平。

表1 N=12的Plackett-Burman實驗設計及結果

由表2可知，營養鹽、精氨酸、賴氨酸、胞嘧啶表現為正效應，谷氨酰胺、葉酸表現為負效應。貢獻值排在前三位的分別為營養鹽、賴氨酸和葉酸，其中可信度大于95%的因素為營養鹽和葉酸，且表現較為顯著，賴氨酸的可信度大于85%，可信度較高。因此確定選定營養鹽、賴氨酸、葉酸為主要影響因素進行下一步最陡爬坡實驗。

表2 各因素水平、效應值及顯著性分析

2.5 最陡爬坡實驗結果

根據表2 Plackett-Burman實驗確定的顯著影響因素為營養鹽、賴氨酸和葉酸，其效應值分別為4.0 g/L、0.40 g/L和0.14 g/L，試驗設計及結果見表3。

表3 最陡爬坡實驗及結果 g/L

由表3可知，最高生物量對應的培養基配方出現在第4組，因此選擇第4組作為響應面的中心點，即營養鹽5.0 g/L，賴氨酸0.45 g/L，葉酸0.16 g/L。

2.6 響應面分析實驗結果

中心組合試驗因素及水平見表4，實驗設計和結果見表5，方差分析見表6。

表4 中心組合實驗因素及水平

表5 中心組合實驗設計及結果

表6 方差分析表

根據表6實驗結果通過Design-Expert進行響應面分析，建立多元二次回歸方程：

Y=0.45+0.0077X1+0.0016X2+0.0044X3+
0.0025X1X2+0.0025X1X3+
0.0045X2X3-0.0099X12-
0.021X22-0.017X32

方程的方差分析結果見表6，模型P<0.01，失擬項不顯著，表明回歸方程擬合程度良好。決定系數R2為0.9642，說明因變量與考察的自變量之間的線性關系顯著。因此，使用該模型可以較好地對巴氏醋桿菌的生物量進行分析和預測。

2.7 培養基最佳配方的確定及驗證實驗

根據2.6響應面分析實驗得到的回歸方程繪制出響應面分析圖(圖9)。該回歸方程的拋物線圖形開口均向下，說明回歸方程存在最大值，即響應面覆蓋了最大值所在的區域。由Design-Expert分析得到最適培養基中三個顯著影響因素對應的實際值分別為：營養鹽5.0 g/L、賴氨酸0.46 g/L、葉酸0.16 g/L。綜上所述，最適培養基的組分為：營養鹽5.0 g/L、精氨酸0.10 g/L、賴氨酸0.46 g/L、胞嘧啶0.70 g/L、谷氨酰胺0.20 g/L、葉酸0.16 g/L。將最適培養基成分帶入上述回歸模型方程，預測巴氏醋桿菌在9%(體積分數)乙醇和1%(體積分數)乙酸脅迫條件下最大生物量可達0.45 g/L。

使用上述優化后的培養基進行搖瓶驗證實驗。實驗分為兩組，生長組設置對照組為5.0 g/L營養鹽培養基，優化后的培養基為實驗組，以此來驗證對生長的影響；耐性組在接種前加入9%的乙醇和1%的乙酸，來驗證對耐性的影響。兩組實驗的生物量及醋酸產量分別如圖6所示。

(a)非醇酸脅迫條件下

由圖6a可知，實驗組發酵結束時的最大生物量為0.65 g/L，比對照組未添加微量元素的5.0 g/L營養鹽培養基的最大生物量提高30%，醋酸產量提高18%，比未優化前的初始營養鹽培養基提高54%。由圖6b可知，實驗組在發酵終點的生物量為0.45 g/L左右，比對照組提高了32%，與模型預測結果相吻合，醋酸產量比對照組提高了14%。

3 結論

對5種有促生長作用的微量元素進行單因素優化預試驗，確定其最佳濃度分別為：營養鹽4.0 g/L、精氨酸0.10 g/L、賴氨酸0.40 g/L、胞嘧啶0.70 g/L、谷氨酰胺0.20 g/L、葉酸0.14 g/L。在此基礎上利用 Plackett-Burman實驗，最陡爬坡實驗和響應面分析實驗對巴氏醋桿菌的發酵培養基進行優化，最終得到的最適發酵培養基組分為：營養鹽5.0 g/L、精氨酸0.10 g/L、賴氨酸0.46 g/L、胞嘧啶0.70 g/L、谷氨酰胺0.20 g/L、葉酸0.16 g/L。對優化后的培養基進行搖床發酵驗證，在此最優培養基中發酵60 h的最大生物量和最大產酸量，比5.0 g/L的純營養鹽培養基提高了30%和18%；在醇酸脅迫條件下的最大生物量和最大產酸量，比5.0 g/L的純營養鹽培養基提高了32%和14%。