血漿Septin9基因甲基化檢測在胃腸道病變中的臨床應用價值評價

王炳龍，湯紀豐，俞子晴，江仁權，何毓玨，林錦驃，歐啟水(福建醫科大學附屬第一醫院檢驗科，福建醫科大學基因診斷研究中心，福建省檢驗醫學重點實驗室，福州 350005)

血漿甲基化Septin9基因(methylatedSeptin9, mSeptin9)檢測是近年來開展的檢驗項目，在臨床實踐中主要作為一種無創輔助診斷結直腸癌的方法。作為一種表觀遺傳的修飾形式，mSeptin9已被證實與多種腫瘤有關[1]，特別是在結直腸癌和胃癌的發生、發展過程中關系密切[2]。然而，mSeptin9基因在許多良性病變中也可被檢出，其在許多疾病中的病理機制和臨床應用價值有待進一步明確。本研究通過回顧性收集2017年5月至2020年11月本院就診的消化系統惡性腫瘤和良性病變(主要為胃腸道病變)患者檢測血漿Septin9甲基化的病例信息，分析血漿Septin9基因甲基化檢測的臨床應用價值，以期為進一步指導臨床實踐，探討mSeptin9的潛在致病機制提供依據。

1 資料與方法

1.1研究對象 回顧性收集2017年5月至2020年11月在福建醫科大學附屬第一醫院檢驗科檢測血漿Septin9基因甲基化的所有病例，經篩選納入診斷為消化系統疾病的患者共2 067例，其中包括1 751例消化系統惡性腫瘤患者(1 276例惡性腫瘤根治術術前的患者和475例術后7 d內的結直腸癌和胃癌患者)以及316例消化系統良性病變患者(主要包括結直腸炎35例、結直腸息肉56例、腸梗阻29例和胃炎107例等，其診斷均符合相應的診斷標準，病理結果排除惡性病變)，另納入20例非消化系統良性病變患者(病理結果排除惡性病變，同時未有證據表明存在消化系統疾病)和41例無疾病證據受檢者作為對照組，同時收集所有納入者的相關臨床資料。其中，男性1 339例，女性789例；年齡13～93歲，中位年齡62歲。單因素回歸分析顯示，各組之間性別構成對Septin9甲基化的檢測結果無影響(P>0.05)，除消化系統良性病變患者(OR=1.037 9，95%CI：1.012 3～1.064 1，P=0.002)和術后結直腸癌和胃癌患者(OR=1.027 9，95%CI：1.008 9～1.047 3，P=0.003 1)外，各組年齡對Septin9甲基化檢測結果無影響(P>0.05)。病例納入標準：(1)所有疾病的診斷均經病理確診且符合相應的診斷標準；(2)均為原發性腫瘤。排除標準：(1)合并其他原發性惡性腫瘤患者；(2)懷孕或哺乳期女性；(3)自身免疫病患者；(4)合并人免疫缺陷病毒感染者。本研究經福建醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審核批準(批準文號：閩醫大附一倫理醫技審[2015]084號及閩醫大附一倫理醫技審[2015]084-1號)，各研究對象知情同意。

1.2主要儀器及試劑Septin9基因甲基化檢測試劑盒(PCR熒光定量法，北京博爾誠科技公司)，QuantStudio DX實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，羅氏E801電化學發光儀(瑞士羅氏公司)。癌胚抗原(CEA)測定試劑盒、糖類抗原(CA)125檢測試劑盒、CA 72-4測定試劑盒、CA 19-9測定試劑盒、甲胎蛋白(AFP)檢測試劑盒(電化學發光法，瑞士羅氏公司)。

1.3標本采集 術前患者于住院第一天采集，術后患者于手術后7 d內采集，無疾病證據受檢者為體檢人群體檢時采集。檢測時采集晨起空腹(禁食8～12 h)靜脈血10 mL，EDTA-K2抗凝，1 350×g離心12 min，重復1次，獲取3.5 mL血漿；同時另采集靜脈血2 mL，促凝膠促凝，2 800×g離心8 min，獲取2 mL血清。

1.4血漿Septin9基因甲基化檢測 所有檢測均在福建醫科大學附屬第一醫院檢驗科完成。取上述血漿標本，按照Septin9基因甲基化檢測試劑盒(PCR熒光探針法)說明書操作。步驟如下：(1)獲取3.5 mL血漿后，對血漿進行裂解、磁珠富集DNA、洗滌、洗脫DNA，將提取的DNA使用亞硫酸鹽進行轉化；(2)將轉化成功后的DNA加入PCR預反應液(含dNTPs、10×PCR Buffer、引物、探針、阻斷劑以及Taq DNA聚合酶，單個反應的反應體系為60 μL，其中30 μL PCR預反應液和30 μL DNA樣本)中進行PCR反應，反應條件:94 ℃活化20 min；62 ℃ 5 s，55.5 ℃ 35 s，93 ℃ 30 s，45次循環;40 ℃ 5 s。結果判斷：在內參基因β-肌動蛋白(β-actin)結果正常的情況下，Ct值≤41.0時結果判為陽性，Ct值>41.0或無Ct值時結果判為陰性。每次實驗均設陽性和陰性對照，陽性和陰性對照均由試劑盒提供，處理方法及流程與受檢者相同。

1.5CEA、AFP、CA19-9、CA12-5和CA72-4檢測 采用電化學發光法，取上述血清標本按照羅氏E801全自動電化學發光儀及配套的試劑盒說明書操作。CEA參考范圍為0～5.2 ng/mL(吸煙者0～6.5 ng/mL)；AFP參考范圍為0～13.6 ng/mL；CA19-9參考范圍為0～34 U/mL；CA12-5參考范圍為0～35 U/mL;CA72-4參考范圍為0～6.9 U/mL。

1.6統計學分析 數據的分析使用SPSS 20.0軟件、MedCalc軟件和SPSSAU 20.0 在線工具進行。對計數資料比較采用列聯表χ2檢驗或Fisher確切概率法；對有等級的計數資料采用Ridit分析；使用單因素Logistic回歸分析判斷年齡和性別對血漿Septin9基因甲基化檢測結果是否有影響；繪制ROC曲線分析血漿Septin9基因甲基化檢測的診斷價值，多因素Logistic回歸分析篩選聯合診斷指標并計算預測概率。所有假設檢驗比較均為雙側，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1血漿Septin9基因甲基化在各組中的表達水平 在所有未經手術治療的病例中，消化系統惡性腫瘤患者共1 276例，占總病例的77.19%。在消化系統惡性腫瘤組和相應部位良性病變組血漿Septin9基因甲基化檢測陽性率的比較中，胃癌(共302例，陽性檢出132例，陽性率43.71%)、肝癌(共9例，陽性檢出7例，陽性率77.78%)和結直腸癌組(共928例，陽性檢出536例，陽性率57.76%)的陽性率均高于相應部位的良性病變組(P<0.01)。在消化系統疾病組和無疾病證據受檢者組(共41例，陽性檢出2例，陽性率4.88%)Septin9基因甲基化檢測陽性率的比較中，胃癌、肝癌、胰腺癌(共5例，陽性檢出3例，陽性率60.00%)、回盲部惡性腫瘤(共10例，陽性檢出7例，陽性率70.00%)、結直腸癌、腸梗阻(共29例，陽性檢出8例，陽性率27.59%)和結直腸息肉組(共56例，陽性檢出12例，陽性率21.43%)的陽性率均增高(P<0.05)。見表1。

表1 血漿Septin9基因甲基化在各組受檢者中的檢測結果分析

2.2血漿Septin9基因甲基化檢測結果與患者的臨床病理參數關系 收集經病理確診的結直腸癌和胃癌患者，分析血漿Septin9基因甲基化檢測結果與臨床病理參數的關系，結果見表2。在結直腸癌患者中，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、存在區域淋巴結轉移和遠處轉移的患者血漿Septin9基因甲基化陽性率較高，差異有統計學意義(P<0.01)；而不同年齡、性別、分化程度、病理分型和腫瘤位置的患者在血漿Septin9基因甲基化的陽性率比較均無統計學意義(P>0.05)。在胃癌患者中，Ⅲ～Ⅳ期和存在遠處轉移的患者血漿Septin9基因甲基化陽性率較高，差異有統計學意義(P<0.001)；而不同年齡、性別、分化程度、病理分型、腫瘤位置及是否存在區域淋巴結轉移對胃癌中血漿Septin9基因甲基化陽性率的比較均無影響(P>0.05)。

表2 血漿Septin9基因甲基化檢測結果與結直腸癌和胃癌患者的臨床病理參數關系

2.3血漿Septin9基因甲基化檢測在結直腸癌和胃癌中的ROC曲線分析 繪制ROC曲線并對結直腸癌組與結直腸良性病變組或無疾病證據受檢者組，胃癌組與胃良性病變組或無疾病證據受檢者組逐一進行分析，結果顯示血漿Septin9基因甲基化檢測在以上各組中的ROC曲線下面積(AUCROC)分別為0.681、0.764、0.649和0.694，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3、圖1A。同時，血漿Septin9基因甲基化在結直腸癌和胃癌中與傳統腫瘤標志物CEA、AFP、CA19-9、CA12-5、CA72-4陽性率的比較中，其陽性率均高于其他腫瘤標志物(P<0.01)。見表4。聯合指標ROC曲線分析表明，在結直腸癌與結直腸良性病變組中，Septin9聯合CEA檢測能將AUCROC提高至0.789(P<0.01)，并將敏感性提高至70.88%。見表3、圖1B。胃癌組中未發現聯合其他診斷指標能改善血漿Septin9基因甲基化檢測的診斷價值(P>0.05)。

表3 血漿Septin9基因甲基化檢測在不同組別中的診斷價值

圖1 血漿Septin9基因甲基化檢測在結直腸癌和胃癌中的ROC曲線分析

表4 血漿Septin9基因甲基化與多種腫瘤標志物陽性率的比較

2.4結直腸癌和胃癌患者手術前后血漿Septin9基因甲基化檢測陽性率的比較 分別比較928例惡性腫瘤根治術術前行血漿Septin9基因甲基化檢測與318例術后7 d內行該檢測的結直腸癌患者、302例術前行該檢測與157例術后行該檢測的胃癌患者的陽性率，結果顯示各組術后血漿Septin9基因甲基化的陽性率(結直腸癌31.45%，胃癌33.76%)均低于術前(結直腸癌57.76%，胃癌43.71%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。同時，收集所有術前檢測結果為陽性且術后半年內又行該檢測的患者資料作進一步分析，結果表明，在結直腸癌和胃癌患者中術后血漿Septin9基因甲基化的陽轉陰率分別為63.33%和69.23%，且存在遠處轉移的結直腸癌患者的轉陰率明顯低于未轉移者，差異有統計學意義(P<0.01)。見表6。

表5 結直腸癌和胃癌患者手術前后血漿Septin9基因甲基化檢測結果的比較

表6 血漿Septin9基因甲基化檢測陽性的結直腸癌和胃癌患者手術前后檢測結果的比較

3 討論

Septin9基因的異常調節和改變參與了多種腫瘤的發生、發展。該基因的異常甲基化已成為多種腫瘤的重要生物學特征，對Septin9甲基化狀態的測定亦已用于多種腫瘤的診斷[3]。在臨床實踐中，Septin9基因甲基化檢測已廣泛開展，但其診斷價值在不同的研究中存在差異[4]。因此，本研究擬通過大樣本回顧性分析血漿Septin9基因甲基化檢測在消化道病變中的診斷價值，為臨床提供參考。

我們的回顧性研究表明，血漿Septin9基因甲基化在術前結直腸癌患者中陽性檢出率為57.67%，這與冷霞等[5]報道的52.10%陽性率以及與張春燕等[6]報道的62.50%陽性率基本一致，但低于趙媛等[4]報道的70%～90%陽性率。在術前胃癌患者中該檢測陽性率為43.70%，接近賀娜等[7]報道的46.90%陽性率和褚文慧等[8]報道的40.52%陽性率。同時，本研究結果顯示血漿Septin9基因甲基化在結直腸癌和胃癌中的檢驗效能均高于CEA、CA19-9和CA12-5等腫瘤標志物。比較各研究的差異發現，本研究中使用的檢測方法和患者納入標準與冷霞等[5]十分相似。與其他研究者在陽性檢出率上的差異可能源于標本來源、檢測方法、患者的治療情況以及樣本量大小的不同。相較其他研究，本研究的優勢主要體現在統計的樣本數量更大以及更接近患者在臨床實踐中的真實受檢狀態。另外，肝癌(7/9，77.80%)和回盲部惡性腫瘤(7/10，70.00%)的陽性檢出率結果表明Septin9基因甲基化檢測有望進一步成為其他消化道腫瘤的輔助診斷指標。

在消化系統良性病變中，我們發現血漿Septin9基因甲基化的陽性率也增高(P=0.036)。ROC曲線分析表明，良性病變中其陽性率的增高降低了良性病變與惡性腫瘤的鑒別能力。結合其他腫瘤標志物聯合診斷(如在結直腸癌中結合CEA)能夠改善Septin9基因甲基化檢測的診斷效能。病理機制上，Septin9基因甲基化陽性率在良性病變中增高是否會促進病變從良性向惡性轉變有待進一步研究。同時，血漿Septin9基因甲基化陽性檢出率在Ⅲ～Ⅳ期的結直腸癌和胃癌患者及術前狀態患者中較高，證明了其甲基化程度與惡性腫瘤的進展和存在有著重要聯系，其甲基化程度可能是提示疾病進展、監測手術效果和患者預后評價的潛在標志物。

在目前的臨床實踐中，血漿Septin9基因甲基化檢測的使用具有一定的局限性。比如，檢測Septin9的費用較高，操作繁瑣；在無癥狀腫瘤患者中敏感性低[9]，限制了該檢測在腫瘤早期篩查中的應用價值等。本研究的局限性主要為缺乏隊列研究，難以進一步評價Septin9甲基化狀態與預后和疾病進展之間的聯系。綜上，血漿Septin9基因甲基化檢測在結直腸癌和胃癌中具有診斷價值，在臨床實踐中結合其他診斷方法可提高其診斷效能。此外，Septin9基因甲基化與腫瘤進展存在相關的特性，表明其檢測在提示腫瘤進展、評價手術效果、評估患者預后上具有廣泛的應用前景，但需要更多的醫學研究支持。