DNA錯配修復蛋白缺失與Ⅱ、Ⅲ期結腸癌根治術后復發轉移、預后的關系研究

蔡郁輝 劉金波 曹 陽 張廷濤 晁宏偉

結腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈明顯的上升趨勢，近年來隨著手術理念的更新、新輔助治療方案的改進及腹腔鏡操作技術的進步，結腸癌患者的總體生存期得到明顯提高[1]。但結腸癌術后的復發轉移仍然是影響患者長期生存的重要因素。DNA錯配修復蛋白(MMR)參與了多種重要的生物學過程，其完整表達對保證細胞遺傳物質的穩定性具有重要意義[2]。若DNA錯配修復系統出現缺陷則可能使細胞出現微衛星不穩定，突變率顯著提高[3]。目前，關于MMR蛋白表達狀態與結腸癌患者預后的關系，在不同的研究中存在著截然相反的研究結論[4-5]。因此，我們回顧性分析了2006年3月至2012年1月我院收治的294例行結腸癌根治術的患者臨床資料，探討MMR缺失與Ⅱ、Ⅲ期結腸癌根治術后復發轉移及預后的關系，以期能為臨床判斷患者預后提供更多、更準確的臨床指標。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2012年3月至2018年1月濮陽市人民醫院普外一科收治的行結腸癌根治術的患者資料。納入標準：①腺癌。②術后病理檢查確認為Ⅱ期或Ⅲ期。③術前未行放化療或生物治療。④行根治性手術治療。排除標準：①同時合并有其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤病史。②圍術期死亡的病例。③臨床資料完整或隨訪數據不全。④患有嚴重臟器功能疾病，如心力衰竭、腎功能不全等。⑤家族性遺傳性結腸癌。⑥術后化療非FOLFOX、5-Fu/LV方案。最終，共納入294例患者，其中男性201例，女性93例。年齡30～82歲，中位年齡59歲。腫瘤分化以中、高分化為主，共228例，低分化66例。Ⅱ期、Ⅲ期分別有128例、166例。

1.2 主要試劑

MLHl鼠抗人單克隆抗體、MSH2鼠抗人單克隆抗體、MSH6鼠抗人單克隆抗體、PMS2鼠抗人單克隆抗體，均采購于美國Abcam公司。DAB顯色試劑盒、免疫組化SP試劑盒分別購自武漢博士德生物工程有限公司、美國Zymed 公司。一抗工作濃度設置為1∶100。

1.3 免疫組化檢測及結果判定

取組織，經甲醛固定、石蠟包埋處理后，切片。脫蠟、水化：采用恒溫烤箱常規脫蠟處理，并快速采用浸入二甲苯中，依次進行由高到低不同濃度乙醇進行水化處理。抗原修復：采用雙氧水孵育，并經高溫(電磁爐1000 w，加熱2 min)抗原修復液修復組織細胞抗原，之后放入涼水中，靜置，待到自然冷卻。丟棄抗原修復液，依次進行PBS沖洗(3遍×3 min)、雙氧水孵育(3%,靜置15 min)、蒸餾水沖洗、PBS浸泡(3遍×3 min)等步驟；滴加工作液，室溫孵育10 min，甩去工作液，加一抗室溫孵育2 h，PBS沖洗(3 min×3次)。加二抗，孵育20～30 min(37 ℃)，采用PBS沖洗(2 min×3次)。顯色，DAB顯色，蘇木精精染(20 s),自來水沖洗(30 min)，采用由低到高濃度酒精梯度脫水，透明、封片、鏡檢。以PBS代替一抗設置陰性對照，以正常大腸黏膜上皮表達設置陽性對照。進行半定量分析，以出現棕色顆粒為HMGA2陽性標準。染色強度無染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計0～3分。同時每張切片在高倍鏡下觀察時，隨機選取10個視野，計數100個細胞，公式：細胞陽性率=陽性細胞/同類細胞總數×100%。根據陽性率進行計分，0(0分)、<25%(1分)、25%～50%(2分)、50%～75%(3分)，>75%(4分)。兩者相乘，根據乘積結果分級：“-”(0分)判定為MMR表達缺失，“+”(1～4分)、“++”(5～8分)判定為MMR低表達，“+++”(9～12分)判定為MMR高表達。

1.4 統計學分析

應用SPSS 20.0軟件分析，MMR狀態與患者臨床病理參數關系分析采用卡方檢驗，多因素分析采用Logistic風險模型。影響復發轉移及總體生存率的危險因素分析采用Cox單因素及多因素模型進行。 生存分析采用kaplan-Meier分析，并采用Log-rank 檢驗比較MMR狀態對患者復發轉移率、總體生存率的影響。檢驗水準α=0.05。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MMR狀態單因素分析

MMR狀態與患者腫瘤部位、分化程度、分期相關(P<0.05)。但與患者性別、年齡、手術切除淋巴結數量、治療模式、化療周期無關(P>0.05)，見表1。

表1 MMR狀態與患者臨床病理參數關系的單因素分析/例

2.2 MMR狀態與患者臨床病理參數關系的多因素分析

將上述單因素分析中有意義的指標納入Logstic回歸模型進行多因素分析，結果發現腫瘤部位、分化程度、分期均是影響HMGA2蛋白表達的獨立性危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 MMR狀態與患者臨床病理參數關系的多因素分析

2.3 影響預后單因素分析

年齡、T分期、分化程度、N分期均為影響患者總體生存率、復發轉移率的危險因素。總體生存率與MMR狀態有關，但復發轉移率與MMR狀態無關。見表3。

表3 影響預后單因素分析/例

2.4 影響患者復發轉移率、總體生存率的多因素分析

多因素分析結果顯示，僅有N分期是影響患者復發轉移率的獨立性危險因素。僅有腫瘤分化程度、N分期、MMR狀態是影響患者總體生存率的獨立性危險因素。見表4。

表4 影響患者復發轉移率、總體生存率的多因素分析

2.5 MMR狀態對患者無病生存率及總體生存率的影響

至隨訪截止日期，220例pMMR患者中，69例出現復發轉移(31.4%)，74例dMMR患者中，13例出現復發轉移(17.6%)，兩組患者的無病生存率差異具有顯著統計學意義(χ2=5.240，P=0.022)。見圖1。220例pMMR患者中，48例死亡(21.8%)，74例dMMR患者中，9例死亡(12.2%)。兩組患者的總體生存率差異具有顯著統計學意義，(χ2=3.934，P=0.047)，見圖2。

圖1 pMMR組與dMMR組5年無病生存曲線 圖2 pMMR組與dMMR組5年總體生存曲線

3 討論

結腸癌具有高度異質性，目前僅有微衛星不穩定檢測[6]、鼠類肉瘤病毒癌基因檢測[7]、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源B基因[8]檢測可應用于結腸癌分期及預后判斷。其中，DNA復制中的錯配修復系統異常可導致微衛星不穩定，在約85%的遺傳性非息肉病性結直腸癌患者中存在著DNA序列的不當表達[9]。然而，在散發性結直腸癌中，微衛星不穩定也有著一定的檢出率。國內針對MMR在散發性結腸癌中表達的研究較少，在我們的研究中，294例患者中，74例患者存在MMR表達缺失(25.2%)，陽性率略低于文獻報道。我們推測這可能與許多研究者均采用了敏感性、特異性更高的逆轉錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)等特異性更高的檢測方法有關。同時，文獻數據幾乎全部來自于國外，中國的研究數據較少，無法排除結腸癌表達的種族性、地區性差異。

單因素分析結果顯示，MMR表達狀態與患者腫瘤部位、分化程度、分期相關。多因素分析結果發現，腫瘤部位、分化程度、分期是影響MMR表達狀態的獨立性危險因素。腫瘤分化程度越低、分期越高，MMR表達缺失的發生率就越高。這與Hinrichsen[10]，Lewis[11]的研究結論一致。我們推測這可能與上皮鈣黏蛋白基因的轉錄受生長因子β信號通路中的 Snail、Twist等基因調控機制相關。MMR表達缺失會抑制上皮鈣黏蛋白基因轉錄，促進細胞間極性消失而誘發上皮-間質轉化(EMT)，而EMT正是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。

在一項大型的多中心的回顧性分析中發現[12]，結直腸癌4中分子亞型CMS2～4的信號通路、遺傳學特征、臨床特征存在明顯差異。CMS1存在微衛星不穩定的特征，好發于結腸近端，預后較差。CMS2則好發于遠端結腸，存在WNT/MYC途徑的異常激活。CMS3也常合并存在微衛星不穩定，且伴有KRAS突變。CMS4則以間質浸潤為特征。研究發現，存在微衛星不穩定的相關腫瘤組織能產生新蛋白，其加工后的肽段可由MHC-1呈遞，因此，微衛星不穩定雖然可影響患者預后，但未來有可能免疫治療的重要靶點。在我們的研究中發現，年齡、分化程度、T分期、N分期是影響患者復發轉移率、總體生存率的危險因素。MMR狀態與患者總體生存率相關，但與復發轉移率無關。進一步的多因素分析結果顯示，僅有N分期是影響患者復發轉移率的獨立性危險因素。僅有腫瘤分化程度、化療與否、N分期、MMR狀態時影響患者總體生存率的獨立性危險因素。這表明。MMR表達缺失可作為判斷結腸癌患者預后的1個可靠指標。

綜上所述,腫瘤部位、分化程度、分期與MMR表達狀態密切相關。MMR表達缺失患者預后明顯較差，可作為判斷患者預后的1個潛在標志物。但本研究為單中心研究，且采用的是敏感性較低的免疫組化法，未來在多中心聯合、增加樣本量、改進檢測技術的基礎上，或能為MMR與結腸癌關系的研究提供更具說服力的臨床證據。