腫瘤相關中性粒細胞誘導人粘液表皮樣癌細胞上皮-間質轉變和侵襲轉移的功能及機制研究

黎哲昊 卜歆 封琳 胡君璧 申亮亮 關鍵

粘液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是最常見的原發唾液腺腫瘤，約占惡性唾液腺腫瘤的35%[1-3]。根據形態學和細胞學的特點，可將其分為低、 中、 高3 種分化類型。其中低分化腫瘤極易發生淋巴結和遠端轉移，五年生存率僅30%[4-5]。明確其發生機制，對于粘液表皮樣癌的診斷、預后評估及靶向治療均具有重要意義。

腫瘤相關中性粒細胞在調控腫瘤生物學行為改變方面發揮重要作用[6-7]。其中，N1型可通過分泌介導T細胞活化等多種方式，發揮抑癌功能；而N2型中性粒細胞可通過分泌金屬基質蛋白酶MMP、血管內皮生長因子VEGF等多種細胞因子的方式促進腫瘤的生長、血管發生等過程。本研究探討了中性粒細胞在調控人粘液表皮樣癌上皮-間質轉變(epithelial-mesenchymal transition, EMT)中的意義，并對其相關機制進行了解讀。

1 材料與方法

1.1 材料

MC3細胞由空軍軍醫大學口腔醫院建立，是來源于涎腺粘液表皮樣癌MEC1的高轉移細胞株，培養液為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液；培養條件為37 ℃、 5% CO2、飽和濕度的孵箱。裸鼠和C57小鼠購自空軍軍醫大學動物實驗中心。兔抗人E-cadherin單抗、兔抗人Vimentin單抗、兔抗人TGF-β多抗(Cell Signaling Technology公司，美國)； 小鼠抗人β-actin單抗及Western印跡試劑盒(Sigma公司, 美國)。

1.2 中性粒細胞的分離與培養

利用頸椎脫臼法處死C57小鼠，分離脛骨和股骨，剪掉兩端后用稀釋液正反沖洗3 次骨髓腔至發白。收集稀釋液，利用70 μm尼龍篩網過濾后，轉移稀釋液至已加入配好小鼠骨髓中性粒細胞分離液(北京索萊寶小鼠骨髓中性粒細胞提取試劑盒)的試管中離心，離心管中出現兩層環狀乳白色細胞層，用吸管小心吸取分離液中位于下層的中性粒細胞層。加入5 mL 紅細胞裂解液去除紅細胞，用洗滌液反復3 次，得到中性粒細胞備用。

1.3 細胞侵襲和遷移實驗

取對數生長期的MC3細胞并以106個/孔的密度接種至六孔板，待細胞貼壁后，將中性粒細胞以106/孔的密度接種至上層的0.4 μm共培養小室(康寧公司， 美國)。48 h后，收集MC3細胞并以105個/孔的密度接種至8 μm Transwell小室；利用有基質膠包被的小室進行細胞侵襲能力檢測，無基質膠包被的小室進行細胞遷移能力檢測； 48 h后，將小室細胞甲醛固定并進行結晶紫染色，用顯微鏡成像。隨機取五個視野，通過image J定量，繪制圖譜。

1.4 Real-time PCR實驗

按上述方式進行共培養實驗，待培養48 h后，分別收集上下室的細胞，用TRIzol試劑提取mRNA，用日本TaKaRa公司的PrimeScript real-time PCR 反轉錄試劑盒進行反轉錄和real-time PCR。

Vimentin上游引物為5′-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3′; Vimentin下游引物為5′- CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3′； TGF-β上游引物為5′- CTCCCGTGGCTTCTAGTGC-3′； TGF-β下游引物為5′- GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG-3′； Snail上游引物為5′- TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3′； Snail下游引物為5′- AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3′； β-actin上游引物為5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′； β-actin下游引物為5′- CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.5 Western印跡

按上述方式處理細胞并進行共培養實驗，收集細胞并加入RIPA裂解液，超聲破碎細胞后4 ℃離心，取上清液，收集總蛋白；經10% SDS-PAGE電泳后電轉至NC膜；分別行5%脫脂奶粉封閉1 h、 1 ∶1000 稀釋的一抗孵育過夜、二抗孵育1 h；通過ECL發光檢測結果。

1.6 裸鼠MC3肺轉移模型建立

培養熒光素酶表達的MC3細胞，并制備成單細胞懸液，密度107個/ml。將裸鼠固定，于尾部中外1/3處進針，進行尾靜脈注射，每只小鼠注射106個細胞。4 周后，給予小鼠腹腔注射熒光素鉀鹽(150 mg/kg)，并利用活體成像儀顯色，觀察肺轉移瘤的形成與否。

1.7 免疫熒光實驗

通過頸椎脫臼法處死小鼠，對肺轉移灶取材，4%甲醛固定后，制成石蠟切片，利用抗Ly6G、抗CD11b、抗Vimentin的一抗混合孵育過夜，利用對應的二抗染色，其中Ly6G為紅色，CD11b為綠色，Vimentin為粉色。

2 結 果

2.1 腫瘤相關中性粒細胞促進MC3細胞遷移和侵襲

Transwell實驗結果顯示，與中性粒細胞共培養后的MC3細胞遷移和侵襲能力顯著增加(圖 1)。結果說明，腫瘤相關中性粒細胞可增強MC3的遷移和侵襲能力。

2.2 腫瘤相關中性粒細胞誘導MC3細胞EMT轉變

EMT是腫瘤發生侵襲和轉移的關鍵步驟，經Western印跡和real-time PCR實驗檢測證明，與中性粒細胞共培養后的MC3細胞中，間質細胞標志分子Vimentin表達升高(圖 2)，提示細胞出現間質化的特征。

2.3 腫瘤相關中性粒細胞激活TGF-β-snail通路

基于TGF-β是調控細胞EMT的關鍵細胞因子，為了驗證中性粒細胞誘導MC3發生EMT的機制，我們對腫瘤相關中性粒細胞中TGF-β的表達量進行了檢測，Western印跡和real-time PCR實驗結果顯示，經與MC3細胞共培養后的中性粒細胞中TGF-β的表達量顯著增加(圖 3A)；而經共培養后的MC3細胞中Snail的表達量也顯著增加(圖 3B)。

圖 1 Transwell實驗檢測MC3細胞的遷移和侵襲能力(×100)

圖 2 腫瘤相關中性粒細胞對Vimentin表達的影響

2.4 腫瘤相關中性粒細胞浸潤于MC3轉移瘤組織

將帶有熒光素酶標記的MC3細胞通過尾靜脈注射入裸鼠內，建立MC3肺轉移模型,并將組織切片進行免疫熒光染色(圖 4A)。其中，Ly6G和CD11b雙陽性的細胞為中性粒細胞(橘紅)，在中性粒細胞高表達的區域，腫瘤中的Vimentin(粉色)的表達量也顯著增加(圖 4B)。

3 討 論

中性粒細胞是固有免疫系統的重要組成部分，在對抗感染和炎癥發生的過程中發揮重要作用。近年來人們發現，在腫瘤發生過程中，中性粒細胞也扮演著重要的角色。實體瘤組織中常常伴有中性粒細胞的浸潤，其表型和功能具有可塑性，分為N1型和N2型[7]。其中，N1型中性粒細胞在腫瘤發生初期較常見，具有細胞毒性，可激活機體的抗腫瘤免疫過程抑制腫瘤的發生發展，例如，通過活化活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導腫瘤細胞凋亡[8-10]；在集落刺激因子GM-CSF作用下通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)方式殺傷腫瘤[11]。而N2型中性粒細胞常稱為腫瘤相關中性粒細胞，常常促進腫瘤的發生發展。目前，人們認識到腫瘤相關中性粒細胞發揮功能的方式主要有以下幾種：(1) 分泌前列腺素E2(PGE2)、MMP9促進腫瘤的增殖[12-13]； (2) 分泌釋放彈性蛋酶NE、組織蛋白酶G參與對細胞外基質的降解[14-15]； (3) 釋放VEGF等促進腫瘤血管的發生[16]。盡管近年來人們對腫瘤相關中性粒細胞的認識逐漸增多，但其如何促進腫瘤的增殖及轉移仍有待于深入研究。

圖 3 中性粒細胞與MC3細胞的交互影響

A: MC3肺轉移小鼠活體成像； B: 肺轉移瘤組織免疫熒光染色

EMT是具有極性的上皮細胞失去緊密粘附的能力，運動能力增強，向紡錘樣間質細胞的特征轉變的過程[17]。EMT過程使得細胞骨架發生改變，細胞具有了更強的移動能力，對個體發育而言，EMT是胚胎期機體組織器官形成的重要途徑[17]；而對于腫瘤細胞而言，EMT是腫瘤獲得侵襲和轉移能力的必經過程[18-19]。細胞粘附分子E-cadherin是上皮細胞的標記分子，對維持細胞上皮樣的形態和細胞骨架至關重要，許多研究表明，腫瘤細胞僅通過抑制自身E-cadherin的表達，便能夠實現EMT過程的轉變[20-21]；此外，間質細胞標記物在EMT過程中表達增加，如波形蛋白Vimentin、鈣黏蛋白N-cadherin、纖粘蛋白Fibronectin等。目前，能夠直接調控EMT的轉錄因子家族成員已經逐漸被人們所認識，如Twist、Snail和ZEB等。其中，Snail在影響細胞EMT的過程中地位突出，通過直接調控E-cadherin等分子的表達，誘導細胞EMT過程的發生，并進一步促進腫瘤的侵襲和轉移[22]。臨床數據顯示，Snail的過表達與肺癌、乳腺癌等多類腫瘤的復發和轉移相關。Snail作為一個重要的分子標志物，在臨床診斷、治療和預后評估中發揮重要作用[23-24]。

該研究利用粘液表皮樣癌模型研究發現，腫瘤相關中性粒細胞可通過促進轉化生長因子TGF-β的表達，誘導MC3細胞內Snail的活化，促進細胞EMT過程的發生，導致的腫瘤的侵襲和轉移。此外，在動物模型中我們也觀察到肺轉移的MC3腫瘤周圍大量浸潤著中性粒細胞，并與Vimentin的表達量呈正相關。

綜上，實驗均證明腫瘤相關中性粒細胞在誘導粘液表皮樣癌EMT、侵襲和轉移過程發揮重要作用，為深入理解腫瘤微環境的調控網絡提供了實驗依據。