載他克莫司可注射溫敏水凝膠促牙髓干細胞成骨向分化作用研究

王芃 何華春 李道偉 孫宏晨 吳立鵬

人牙髓干細胞(human pulp stem cells，hDPSCs)是組織再生醫學領域研究的熱點之一[1]。hDPSCs的獲取方便，可以由患者自身牙齒的自體細胞提供。hDPSCs是干細胞，能夠多向分化為成牙本質細胞，神經源性細胞，脂肪細胞細胞等[2]。由于它們有向成骨分化的能力[3]，可作為骨組織工程中細胞的選擇。

他克莫司FK506是一種強效的免疫抑制劑，廣泛用于實驗和臨床中的預防移植后的器官排斥和治療自身免疫性疾病[4]。有研究報道，FK506的治療可能會增加骨量，并可能對骨缺損是一種潛在的治療方式[5]。

本研究提出一種由可注射溫敏水凝膠與FK506復合材料(FK506-TH)制備的生物相容性骨修復材料。單純應用FK506存在半衰期短、價格昂貴、易降解等問題，因此，常需與合適的藥物控釋系統復合，以保證其在損傷處持續高效釋放，更好的發揮促進組織再生的作用。而載有促進組織修復藥物的水凝膠材料在達到適宜溫度時凝結成膠狀固體，更具有藥物緩釋性能。在保證FK506藥物正常發揮功能的同時，增加了可溶性溫敏水凝膠的協同促進作用，以期獲得具有較大性能空間的材料。長期、持續、少量的給藥形式，有望在個性化醫療中得到應用。本文旨在探討載FK506可注射溫敏水凝膠(FK506-TH)作為一種有效的骨修復材料是一種有前景的治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設備

FK506、ALP試劑盒、茜素紅S(Sigma公司，美國)；胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美國)；青霉素鏈霉素雙抗溶液(PAA公司，美國)；Cell Counting Kit-8(DOJINDO Laboratories公司，日本)；引物(Takara公司，日本)；酶標檢測儀(Bio-TEK公司，美國)；PCR擴增儀(Thermo公司，美國)。

1.2 FK506-TH水凝膠的制備

FK506儲存液的制備：使用電子天平在稱量紙上稱取5 mg FK506粉末，放置于超凈工作臺內，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于1.22 mL DMSO溶劑中，配置成濃度為5 mmol/L的FK506儲存液，放于-20 ℃備用。

56%β-甘油磷酸鈉溶液的制備：在稱量紙上稱取4.48 g β-甘油磷酸鈉粉末，放置于超凈工作臺內，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于8 mL H-DMEM培養基(含10%FBS、1%青霉素、1%鏈霉素)，0.22 μm濾器過濾，放于4 ℃備用。

2%殼聚糖鹽酸溶液的制備：在稱量紙上稱取0.8 g CS粉末，放置于超凈工作臺內，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于40 mL H-DMEM培養基中，磁力攪拌至顆粒完全溶解，濃鹽酸調節pH至7.0， 0.22 μm濾器過濾，現配現用。

0.5%明膠溶液的制備：在稱量紙上稱取0.05 g明膠粉末，放置于超凈工作臺內，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于10 mL H-DMEM培養基中， 0.22 μm濾器過濾，放于4 ℃備用。

將8 mL β-甘油磷酸鈉溶液逐滴地加入到40 mL 2%殼聚糖鹽酸溶液中，產生絮狀沉淀，再加入1 mL明膠，配置成FK506-TH， 0.22 μm濾器過濾為可注射溫敏水凝膠浸提液。使用過程中，用可注射溫敏水凝膠浸提液將5 mmol/L的FK506稀釋至10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 nmol/mL。

1.3 hDPSCs的分離提取及培養方法

收集2018 年12 月～2019 年1 月吉林大學口腔醫院18～30 歲志愿者因埋伏阻生而拔除的無病變第三磨牙，酶消化法培養hPDSCs，取生長狀態良好的第三代hDPSCs以1×105個/孔的密度接種在6 孔板中(2 mL/孔)，設置實驗分組為空白對照組、可注射溫敏水凝膠組、FK506組、載FK506可注射溫敏水凝膠組。

1.4 FK506-TH的細胞毒性實驗

CCK-8實驗測定FK506-TH浸提液濃度為0、 10、 50、 100、 500、 1 000、 1 500、 2 000 nmol/L對hPDSCs增殖的影響， 平行實驗重復3 次。

1.5 FK506-TH促進成骨分化實驗

成骨誘導液的制備：可注射溫敏水凝膠浸提液(含10%胎牛血清、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-8mol/L地塞米松)。

按照上述1.3方法接種細胞，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。貼壁后換為成骨誘導液，分別誘導3、7、14 d， 每3 d換液，未處理的細胞為陰性對照。采用Real-time PCR檢測ALP、COLI1、Runx2、OCN和OPN表達水平。

1.6 茜素紅染色

按照上述1.3方法接種細胞，在37 ℃、 5% CO2培養箱中孵育。貼壁后換為成骨誘導液，繼續培養21 d，每3 d換液。

染色方法：染色前去除原培養液，PBS沖洗3 次，用3 mL預冷的95%乙醇溶液在4 ℃條件下固定1 h，三蒸水沖洗3 次，加入茜素紅S染液3 mL放于4 ℃持續染色30 min，PBS洗凈浮色，觀察并拍照。

茜素紅染色定量：每孔加入1 mL 10%氯化十六烷基吡啶(10 mmol/L PBS配置，pH為7.0)，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育30 min，吹打混勻后加入96 孔板內，使用酶標儀在450 nm處測定吸光度，記錄結果，計算所有復孔的平均值，平行實驗重復3 次。

1.7 堿性磷酸酶染色

按照上述1.3方法接種細胞，在37 ℃、 5%CO2培養箱中孵育。貼壁后換為成骨誘導液，繼續培養7 d，每3 d換液。

染色方法：ALP固定液(檸檬酸-丙酮-甲醛固定液)預熱至26 ℃，固定細胞30 s，去離子水輕輕沖洗45 s， 37 ℃ ALP染色液避光染色15 min，去除染液，去離子水沖洗2 min，蘇木精染液復染2 min，自來水洗凈浮色，觀察并拍照。

ALP染色定量：培養7 d后，酶消化法收集細胞，裂解細胞，收集上清液并與堿性磷酸酶測定混合，使用酶標儀在405 nm處測定吸光度，記錄結果，計算所有復孔的平均值，平行實驗重復3 次。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 FK506-TH適宜濃度的選擇

單純水凝膠(0 nmol/L)能明顯促進hDPSCs增殖(P<0.001)，濃度(10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 nmol/L)的載FK506可注射溫敏水凝膠浸提液均可促進細胞增殖(P<0.05)。當濃度為500 nmol/L時促進細胞增殖的作用更明顯(P<0.01)(圖 1)。因此，選擇500 nmol/L濃度的載FK506可注射溫敏水凝膠浸提液用于后續檢測促成骨分化能力的實驗。

圖 1 FK506-TH浸提液對 hDPSCs增殖的影響(*: P<0.5,**: P<0.1, ***: P<0.01)

2.2 FK506-TH對成骨相關基因表達的影響

圖 2顯示，在hDPSCs培養體系中成骨誘導3 d后，與空白對照組相比，單純FK506組和FK506-TH組成骨相關基因ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達均上調(P<0.05)，FK506-TH組Runx2、OPN的表達上調更明顯(P<0.01)。相對于單純FK506組，FK506-TH組ALP、COLI1、Runx2的表達明顯上調(P<0.01)，OCN、OPN的表達上調不明顯(P<0.05)。加入藥物7 d后，與空白對照組相比，單純FK506組和FK506-TH組ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達均上調(P<0.01)，FK506-TH組ALP、COLI1、OCN的表達上調更明顯(P<0.001)。FK506-TH組ALP、COLI1、OCN和OPN的表達均高于單純FK506組(P<0.05)，其中Runx2的表達明顯上調(P<0.01)。加入藥物14 d后，與空白對照組相比，單純FK506組和FK506-TH組ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達均上調(P<0.01)，FK506-TH組ALP的表達上調更明顯(P<0.001)。FK506-TH組相對于單純FK506組，ALP的表達上調不明顯(P<0.05)，而COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達顯著提高(P<0.001)。

2.3 茜素紅染色和定量

成骨誘導21 d，茜素紅染色顯示，空白對照組與單純水凝膠組、FK506組、FK506-TH組3 組，均可見鮮紅色鈣化結節，且與空白對照組相比，其余3 組形成的鈣結節明顯多于空白對照組，其中FK506-TH組鈣化結節形成更多(P<0.001)(圖 3～4)。

2.4 堿性磷酸酶染色和定量

誘導7 d后，ALP染色顯示，空白對照組與單純水凝膠組、FK506組、FK506-TH組3 組，均可見細胞核呈藍色，且與空白對照組相比，其余3 組較空白對照組染色細胞多，其中FK506-TH處理的細胞中，更多的ALP細胞簇呈陽性(P<0.001)。

圖 3 FK506-TH浸提液對hDPSCs礦化能力的影響

圖 4 FK506-TH浸提液對hDPSCs ALP活性的影響

3 討 論

FK506是鈣調神經磷酸酶抑制劑，鈣調神經磷酸酶是一種參與NFAT活化的酶。NFATc1是神經鈣蛋白的下游底物，在T細胞活化時表達強烈[6]。NFATc1又是破骨細胞生成所必需的[7]。破骨細胞是多核的、骨吸收細胞，在骨重建和鈣穩態調節中是必不可少的[8]。已有學者提出，FK506可以通過體外靶向鈣調神經磷酸酶-NFAT途徑抑制破骨細胞形成[9]。研究結果的復雜性表明，對破骨細胞的抑制作用只是藥物對骨影響的一個部分，成骨細胞也表達鈣調神經磷酸酶。有研究報道，鈣調神經磷酸酶在調節成骨細胞的起源和功能中發揮作用[10]。FK506可以促進成骨細胞的轉錄因子的表達，包括Runx2、OPN和OCN[11]。水凝膠具有一定的力學性能，非常適合藥物和細胞的局部植入[12]，也能形成三維水凝膠結構與適應的網格大小，以促進藥物傳遞和細胞移植[13]。

為了明確FK506-TH對體外成骨細胞分化及成熟的作用，本研究通過酶解法提取hDPSCs，并分別在可注射溫敏水凝膠、FK506、FK506-TH 3 種條件下探究不同藥物對hDPSCs的影響。首先，細胞毒性實驗表明，支架材料可注射溫敏水凝膠及FK506-TH(0～2 000 nmol/L濃度)無細胞毒性，在體外易于hDPSCs的附著和增殖，具有良好的生物相容性，二者的協同促進作用使他們成為再生醫學領域的理想材料。RT-PCR顯示成骨誘導3 d時，FK506-TH作用后，ALP表達水平上調顯著，ALP是成骨分化早期的基因，表明成骨細胞活性高。COLI1和Runx2骨形成標志物的顯著增加可以表明培養基中含有較高的骨基質。成骨誘導7 d時，Runx2得表達顯著增加，說明hDPSCs有較高的成骨活性，Runx2是成骨分化過程中的關鍵基因，在成骨分化的各個時期均發揮重要的調控作用。14 d時，ALP的表達上調不明顯，可能受多種因子的影響，在本實驗中不能明確FK506-TH對ALP的作用。而COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達顯著提高，OCN和OPN的含量高代表已形成了成熟骨基質。綜合以上RT-PCR結果分析，FK506-TH在成骨分化各期均可明顯促進成骨相關基因的表達，因而證實FK506-TH可以發揮一定的促成骨作用，并且相對于單純FK506藥物，其促成骨作用更強。為了進一步驗證RT-PCR的結論，本實驗同時進行了茜素紅鈣結節染色和堿性磷酸酶活性檢測。二者的結果均證實：可注射溫敏水凝膠、FK506、FK506-TH均可促進hDPSCs分化和礦化，且FK506-TH顯示出更強的促成骨分化能力。其臨床應用價值有待體內實驗進一步研究。