離心沉淀法制備細胞透射電鏡樣品的技術改進*

陳彥儒 王立言 郝 晶 劉尚明 張向紅△

（1 山東大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，濟南 250012；2 山東第一醫科大學，濟南 250022）

細胞樣品制備超薄切片通常采用離心沉淀法，即將細胞懸浮后離心，積聚成團塊，再進行常規電鏡制樣。這種方法要求有足夠的細胞數量且細胞團塊比較牢固，否則會因為沉淀物太少難以轉移到包埋模具中；而且由于包埋過程中換液次數較多，每次換液細胞團都會被沖散，因此，對于細胞數量不夠多的樣本，比如通常條件下難以生長的培養細胞、臨床送檢的血液及胸腹水標本等，多次離心后很難得到足夠的細胞樣品，最終導致制樣失敗。本室為長期對外開放的服務單位，服務過程中會接觸到大量的細胞樣品，這些樣品有的是由于收集困難導致送檢的細胞數量本來就很少，有的由于各種原因導致細胞不易聚集成團。很多標本取材不易，非常珍貴，制樣失敗會給送樣者造成不可挽回的損失。為解決這些問題，筆者通過長期摸索，對利用離心沉淀法制備細胞透射電鏡樣品積累了一定的經驗，報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗樣品

均來自技術服務過程中送樣的細胞樣品，包括體外培養細胞，如巨噬細胞、成骨細胞、腫瘤細胞等以及細菌等微生物，血液、骨髓、胸腹水等液體中分離出來的細胞等有形成分。

1.2 主要實驗試劑

戊二醛、鋨酸等固定劑，Ep812環氧樹脂等包埋劑，醋酸雙氧鈾，檸檬酸鉛等染色劑，均購自北京中鏡科儀器有限公司。

1.3 主要實驗儀器

恒溫干燥箱，英國劍橋ULTRCUT E型超薄切片機，日本電子1200EX型透射電子顯微鏡。

1.4 細胞的收集

培養的貼壁細胞通常采用胰酶消化或刮除離心法，懸浮培養或其他含有游離細胞的液體直接離心。將含有細胞的液體倒入1.5 mL的尖底離心管中，根據不同的細胞類型選擇不同的離心速度和時間，一般是以1 000～3 000 r/min離心10～15 min。如果細胞過于分散，液體太多，可先在普通離心管中低速離心數分鐘，去掉上清，將下層濃縮的液體轉移到1.5 mL的尖底離心管中再次離心。

1.5 固定與清洗

離心后的樣品去掉上清，立即加入3%的戊二醛，放入4℃冰箱內固定保存（至少2 h以上）。經過一定時間后或收集到一定數量的樣品后，再開始集中包埋。先用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗2次，每次10～15 min，1%的鋨酸4℃冰箱內固定1 h，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗2次，每次10～15 min。

鋨酸固定過程中對樣品進行分類，細胞數量多且團塊比較緊密，用牙簽沿管壁輕輕撥動將細胞團懸浮，按常規樣品處理，其他樣品進行分組；（1）細胞團塊比較疏松，換液時可能會被沖散或有少量細胞丟失，在鋨酸固定后將細胞包裹在擦鏡紙中放入青霉素小瓶中進行后續處理（圖1）；（2）細胞團塊非常小，只在離心管底部可見少量沉淀物，在后續更換液體時要注意避免吸管觸碰到細胞，沿管壁緩緩加入新液，避免水流太急將細胞打散；（3）前2組中各留取1個樣品按常規方法進行處理，作為對照組。

圖1 擦鏡紙包裹樣品的過程

1.6 脫水與浸透

所有樣品均采用梯度脫水法，30%、50%、70%、90%的乙醇，90%乙醇：90%丙酮=1∶1混合液，90%的丙酮、100%丙酮脫水2次，每次10～15 min；浸透亦梯度進行，包埋劑：100%丙酮（1∶3、1∶1、3∶1）分別浸透1、4、12 h以上。

1.7 包埋與聚合

第1組樣品，將擦鏡紙打開，用牙簽將其中的細胞團塊轉移到包埋模具中；第2組樣品將浸透液去除干凈后，直接加入純包埋劑至離心管的1/3～1/2處；對照組2個樣品，其中一個在脫水過程中細胞完全丟失，另一個僅余針尖大小的細胞團，按常規方法轉移至包埋模具中。包埋后在恒溫干燥箱中升溫聚合。聚合溫度與時間分別為：37℃，12 h；45℃，12 h和60℃，24～48 h。

1.8 超薄切片

聚合后的樣品包埋塊在ULTRCUT E型超薄切片機上制備50～70 nm的超薄切片。第1組樣品，按常規修塊、切片；第2組包埋在離心管中的樣品，先用單面刀片將離心管切開，取出其中的包埋塊，再進行修塊、切片；第3組樣品一個沒有得到包埋塊，另一個因殘留組織太少，不能滿足修塊、切片的要求，沒有進行超薄切片。

1.9 電子染色

將1、2組樣品的超薄切片采用滴染法進行醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙染色，先用醋酸雙氧鈾鈾染30 min，雙蒸水沖洗干凈后，再用檸檬酸鉛鉛染15 min，雙蒸水沖洗。

1.10 電鏡觀察

染色后的超薄切片充分干燥后用日本電子1200EX型透射電子顯微鏡觀察。

2 結果

用擦鏡紙包裹及直接在離心管包埋的2組樣品均能得到有效包埋塊。微量細胞樣品在整個操作過程中幾乎未觸碰細胞，基本杜絕了細胞離散；細胞數量和聚集程度均能滿足超薄切片需要，包埋塊切割性能良好，沒有發生切片困難或切片破碎等現象（圖2）；電鏡下觀察細胞的超微結構保存完好，結構清晰，低倍下可見細胞數量多且呈單個均勻分布，細胞之間有一定的間隙，沒有擠壓重疊，也沒有因為離心而導致細胞擠壓變形（圖3）。按常規方法處理的對照組由于細胞丟失無法得到有效的包埋塊，不能進行超薄切片，導致制樣失敗（圖4）。

圖2 Ependorf 管樣品（A）和擦鏡紙包裹樣品的包埋塊及完整切片（B）.

圖3 前2組樣品在透射電鏡下的觀察結果。A：高倍鏡下透射電鏡圖；B：低倍鏡下完整細胞的透射電鏡圖，bar=2 μm.

圖4 對照組包埋的樣品太小（箭頭所指）時，無法修塊和切片.

圖5 瓊脂包埋后切片超薄切片和透射電鏡圖片

3 討論

細胞樣品中由于細胞體積較小，且有時候數量又少，另外由于收集細胞方式的多樣化，給電鏡樣品的制備帶來一定的難度。尤其是胸、腹水，表皮下或深層組織的針吸細胞、外周血、骨髓穿刺以及精液等分散體系進行電鏡制樣時，包埋前的處理更是困難，處理不當極易造成樣品的分散和丟失[1]。對此，筆者曾采用瓊脂預包埋的方法，或加入血漿及牛血清白蛋白的方式以增加細胞的黏附性[2-3]。這些方法操作比較復雜，不太適用于大批量樣品的制備，有時候還會因為溫度把控不當，容易造成細胞變形。另外，由于細胞在瓊脂及血清蛋白中呈散在分布，電鏡下能夠觀察到的細胞數量較少。瓊脂及血清蛋白等非細胞成分的存在還會導致樣品內部硬度不同而造成切片困難或標本破碎[4]（圖5）。采用擦鏡紙包裹離心沉淀物的方法操作簡單[5]，但如果在鋨酸固定之前進行會增加鋨酸的用量，造成試劑浪費。

筆者根據多年工作的經驗，將樣品依據離心沉淀物的大小和前固定后清洗的情況進行分類處理，使所有樣品都能得到滿意的結果。對微量細胞樣品采取在離心管中直接包埋的方法，使離心后的細胞不做任何移動，既能使操作達到最簡，又能防止細胞丟失；對易分散的樣品在鋨酸固定后用擦鏡紙包裹離心沉淀物，既不增加鋨酸的用量，又避免擦鏡紙被鋨酸固定后變黑不易辨別其中的細胞；對滿足常規制樣要求的細胞進行懸浮，有利于鋨酸的固定及脫水劑的滲透。因此筆者的方法對所有樣品均不添加任何介質，既不影響包埋塊的切割性能，又有利于電鏡觀察。

在長期的對外服務工作中，針對各種樣品的制備摸索出了下面的經驗。①對于貼壁培養的細胞，懸浮后會破壞細胞的生長狀態，要觀察細胞在生存狀態下的形態，不適合用離心沉淀法的樣品，需要進行原位包埋[6]。②對于預知離心沉淀物太少不能達到常規制樣要求時，可用1 mL乃至0.5 mL的尖底離心管離心，有利于聚合后的修塊。不建議全部使用1 mL或0.5 mL的離心管，以免固定液及脫水劑用量太少，影響固定及脫水效果。③關于消化離心法，雖然操作方便簡單，但會造成細胞外形、表面及內部結構均發生變化；刮除離心法可保留大部分細胞的形態及細胞間關系，細胞排列有序，有明顯的細胞間連接[7]。指導送樣者收集細胞時，推薦使用刮除離心法。④刮除細胞時最好采用自制的橡膠刮，方法是剪一塊青霉素小瓶的瓶蓋，用止血鉗夾住弧形的一邊，用另一端的平面緊貼培養瓶沿一個方向輕輕刮除細胞，1個位置只刮1遍。不建議使用金屬刮，以免將細胞刮破或使鐵屑留在樣品中影響切片。⑤離心參數直接影響樣品的收集及后續操作，細胞量過少或黏附性差時，有時候不得不增加離心速度和時間，但這對超微結構的破壞也必然隨之增加。離心參數的選擇與操作人員的經驗有關[8]，筆者推薦使用的離心參數為1 000～3 000 r/min離心10～15 min，這種條件下，細胞的超微結構保存良好，也不易發生細胞離散或者不能包埋的情況。⑥細胞中有雜質，如果細胞中有雜質，離心后細胞團底部會有黑色物，可經戊二醛固定后取出細胞團，在顯微鏡下用刀片切掉[9]；如果細胞太少不能做到，切片時不能用鉆石刀片，以免損壞刀口。這時可以采用玻璃刀切片，這樣可能會產生刀痕，但只要用孔徑較小的載網撈片，在電鏡下仔細觀察仍能找到完整的細胞，不會影響超微結構分析。⑦直接在離心管中包埋的樣品，包埋劑不要加太多，如果聚合后包埋塊太大，裝在超薄切片機的樣品夾中露出太多，可先用刀片或挫刀將包埋塊底部修去一部分，避免超薄切片出現顫痕。