MiR-610通過下調雙微體基因2的表達抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移*

周淑敏 趙二趁 蘇 晴 宋艷芳 王志景

（1 周口市中心醫院病理科，周口 466000；2 新鄉醫學院第三附屬醫院婦產科，新鄉 453003）

卵巢癌是第二常見的婦科癌癥，65%的卵巢癌確診時已為晚期，并且轉移到遠處的器官，而晚期卵巢癌的5年生存率約為30%[1-2]。微小RNA（MicroRNA，miR）通過轉錄后調控網絡控制各種細胞過程。現已發現，miRNA在各種人類癌癥中有異常表達，并且作為致癌基因或腫瘤抑制因子調節癌癥的發展。研究表明，miR-610在多種癌癥中發揮抑癌作用，如miR-610通過直接靶向酰基甘油激酶在口腔鱗癌中發揮抑癌作用[2]，通過靶向TWIST1表達抑制骨肉瘤的致瘤性[3]，通過靶向脂蛋白受體相關蛋白6抑制黑色素瘤的腫瘤生長[4]。Sun等[5]研究表明 miR-610在結直腸癌中表達降低，miR-610的異位表達抑制細胞增殖，遷移和侵襲，并上調E-鈣黏著蛋白（E-carderin）表達和下調N-鈣黏著蛋白（N-cadherin）表達，但miR-610在卵巢癌中的作用和機制尚不清楚。卵巢癌高死亡的原因是確診時卵巢癌已經轉移擴散，而腫瘤細胞的遷移和侵襲能力反映了腫瘤的轉移性[6]。本研究主要探討miR-610通過調節雙微體蛋白（double minute 2，MDM2）的表達對卵巢癌細胞侵襲和遷移的作用，以期為卵巢癌的分子治療提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養基（北京清大天一科技有限公司，貨號：MD800）；胎牛血清（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：QS071），青霉素和鏈霉素雙抗溶液（北京沃比森科技有限公司，貨號：C0160-611），Lipofectamine 2000轉染試劑（上海少辛生物科技有限公司，貨號：11668-019），miR-NC、miR-610 mimic、miR-610 inhibitor、pc-MDM2質粒及各種引物由北京奧科有限公司設計并合成，SYBR-Green PCR試劑盒（嘉興藍諾盛生物科技有限公司，貨號：RT0411-03），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京威格斯生物技術有限公司，貨號：T002），cDNA逆轉錄試劑盒（上海彩佑實業有限公司，貨號：C-8020），Transwell 小室（上海玉博生物科技有限公司，貨號：3599），BCA試劑盒（西安浩特生物科技有限公司，貨號：WB027），RIPA裂解緩沖液（上海雅酶生物科技有限公司，貨號：PC101），GAPDH抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、鼠MDM2抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆二抗（上海艾博抗生物公司，貨號：ab18602、ab1416、ab18203、ab16895、ab6728）。

1.2 組織樣品

該研究根據《赫爾辛基宣言》的道德準則進行，并獲得周口市中心醫院研究倫理委員會和臨床醫學學院的批準。組織樣品從本院進行腫瘤切除術中獲取，所有志愿者均同意，并簽署了書面知情同意書。

1.3 細胞及培養

正常卵巢上皮細胞系HOSEpiC 和6種人宮頸癌細胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、HO8910、CaOV-3 和COC1均購自ATCC，在37℃、5%CO2條件下，于RPMI-1640培養基（10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和鏈霉素雙抗溶液）中培養。

1.4 RT-PCR檢測miR-610與MDM2 mRNA的表達

將正常卵巢組織和卵巢癌組織剪碎，并研磨，然后裂解提取總RNA，并用cDNA逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。對于細胞，將正常卵巢上皮細胞系HOSEpiC 和6種人宮頸癌細胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、HO8910、CaOV-3和COC1接種在12孔板中，當細胞達到近85%融合時，用RIPA裂解提取總RNA，并用cDNA 逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。按SYBR-Green PCR 試劑盒說明書操作進行RT-PCR。miR-610的循環條件為：95℃ 15 s 和61℃ 35 s的40個循環，用U6 標準化。MDM2的循環條件：94℃ 20 s 和60℃ 60 s的40個循環，用GAPDH 標準化。使用2-ΔΔct方法計算。每個樣品進行3次重復分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 細胞轉染

取對數期HO8910細胞，以每孔1×106密度接種于12孔板。當達到85%融合，根據Lipofectamine 2000 說明書按照分組將miR-NC、miR-610 mimic、miR-610 inhibitor、pc-MDM2 質粒分別或聯合轉染進入HO8910細胞。

1.6 劃痕實驗檢測

將1.5 中轉染的HO8910細胞以每孔1×106的密度接種在12孔板中，并鋪滿單層，然后再用小號槍頭在孔中間垂直劃痕并拍攝圖像。接著，在37℃、5%CO2條件的培養箱培養24 h后拍攝的圖像。細胞遷移能力用Image J 檢測的劃痕閉合率來表示。劃痕閉合率（%）=（0 h時的劃痕面積-24 h時的劃痕面積）/ 0 h的劃痕面積×100%。

1.7 Transwell 法檢測

用Matrigel 包被過的Transwell 小室上室，4℃晾干。將1.5 轉染的HO8910細胞重懸于無血清的RPMI-1640培養基，接種至Transwell 小室上室中。將含血清的培養基加入Transwell 小室下室。在37℃、5%CO2條件的培養箱培養48 h后，取出Transwell 小室下室。75%預冷的乙醇固定30 min，再用0.1%結晶紫染色10 min。在顯微鏡下觀察分析，侵襲能力用每視野的平均細胞數表示。

1.8 免疫印跡法檢測

收集1.5 轉染的HO8910細胞用RIPA裂解液提取總蛋白，然后用BCA試劑盒定量蛋白的濃度。將蛋白樣品用SDS-PAGE分離后，再用半干轉膜儀轉移到聚偏二氟乙烯膜，室溫下于脫脂牛奶中封閉蛋白2 h。接著，加入對應的兔來源的單克隆一抗（GAPDH 1∶1 000、E-cadherin 1∶800、N-cadherin 1∶500、MDM2 1∶1 000），于4℃封閉過夜。然后，加入對應辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆二抗（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴電化學反應液曝光。以GAPDH為內參，使用軟件ImagePro Plus 6.0分析蛋白條帶灰度，蛋白相對表達水平=目標蛋白積分吸光度值/內參蛋白GAPDH積分吸光度值。

1.9 雙熒光素酶報告基因檢測

收集生長至對數期的HO8910細胞，接種于24孔板中，并在37℃、5%CO2條件的培養箱培養24 h。然后，將1 μg PGL3-MDM2-WT（MDM2野生型）或PGL3-MDM2-MUT（MDM2突變型）以及miR-NC 或miR-610 mimic 和PRL-CMV質粒共轉染入HO8910細胞。轉染48 h后，HO8910細胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統測量熒光素酶的相對活性，熒光素酶的相對活性（R/F）=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.10 統計學處理

數據采用SPSS 21.0 進行統計學分析，所有實驗數據以±s表示。所有數據經Shapiro-Wilk 檢驗，符合呈正態分布，多組比較進行單因素方差分析，兩組比較使用SNK 檢驗，校驗標準α=0.05（雙側）。

2 結果

2.1 MiR-610在卵巢癌組織和細胞中均低表達

與鄰近的正常組織相比，miR-610在卵巢癌組織中明顯下調（P＜0.01）（圖1A）；與正常卵巢上皮細胞系HOSEpiC 相比，在人宮頸癌細胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、HO8910、CaOV-3和COC1 中miR-610表達明顯下調（P＜0.01）（圖1B），并選擇下調效果比較明顯的HO8910細胞系進行后續實驗。與對照組相比，miR-NC組miR-610表達并無變化，miR-610 mimic組miR-610表達明顯上調（P＜0.01），miR-610 inhibitor組miR-610表達明顯下調（P＜0.01），表明轉染成功，可進行后續實驗（圖1C）。

圖1 RT-PCR檢測miR-610的表達水平

2.2 MiR-610抑制卵巢癌HO8910細胞遷移和侵襲能力

與對照組相比，miR-NC組卵巢癌HO8910細胞劃痕閉合率、侵襲細胞數目及相關蛋白表達并無變化，miR-610 mimic組卵巢癌HO8910細胞劃痕閉合率明顯降低、侵襲細胞數目明顯減少、E-cadherin明顯上調、N-cadherin表達明顯下調（P＜0.01），miR-610 inhibitor組卵巢癌HO8910細胞劃痕閉合率明顯升高、侵襲細胞數目明顯增多、E-cadherin明顯下調、N-cadherin表達明顯上調（P＜0.01）（圖2）。

圖2 MiR-610 抑制卵巢癌HO8910細胞遷移和侵襲能力

2.3 MiR-610 靶向下調MDM2

經過生物信息網站TargetScan 數據庫預測，miR-610與MDM2 存在靶向關系，且在 3'UTR區存在結合位點。通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶向關系（圖3A），與MDM2-WT+ miR-NC組、MDM2-MUT+ miR-NC組和MDM2-MUT+miR-610組相比較，MDM2-WT+ miR-610組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01）（圖3B）。與鄰近的正常組織相比，MDM2 在卵巢癌組織中明顯上調（P＜0.01）（圖3C）。在卵巢癌中，MDM2表達與miR-610表達負相關（r=0.9192）（圖3D）。

與對照組相比，miR-610 mimic組MDM2表達明顯下調（P＜0.01），pc-MDM2組MDM2表達明顯上調（P＜0.01）；與miR-610 mimic組相比，miR-610+pc-MDM2組MDM2表達明顯上調（P＜0.01），表明轉染成功（圖4）。

2.4 MiR-610 通過靶向下調MDM2 抑制卵巢癌HO8910細胞遷移和侵襲能力

結果顯示（圖5），與對照組相比，miR-610 mimic組卵巢癌HO8910細胞劃痕閉合率明顯降低、侵襲細胞數目明顯減少、E-cadherin 明顯上調、N-cadherin表達明顯下調（P＜0.01），pc-MDM2組卵巢癌HO8910細胞劃痕閉合率明顯升高、侵襲細胞數目明顯增多、E-cadherin 明顯下調、N-cadherin表達明顯上調（P＜0.01）；與miR-610 mimic組相比，miR-610+pc-MDM2組卵巢癌HO8910細胞劃痕閉合率明顯升高、侵襲細胞數目明顯增多、E-cadherin明顯下調、N-cadherin表達明顯上調（P＜0.01）。

圖3 MiR-610 靶向下調MDM2

圖4 各組中MDM2的表達水平

圖5 MiR-610 通過靶向下調MDM2 抑制卵巢癌HO8910細胞遷移和侵襲能力

3 討論

MiRNA 是一組參與基因表達調控的非編碼RNA，對細胞增殖、侵襲、凋亡和分化等多種生命活動具有調節作用。越來越多的證據表明，miRNA 在各種類型的人類癌癥中異常表達，但其在腫瘤發生中的功能和分子機制仍不明確[7]。鑒別癌癥相關miRNAs 將有助于改善靶向性和開發新藥。卵巢癌中也存在miRNA的異常表達，如miR-142、miR-203 等[8-9]。異常表達的miRNA 在癌癥的發展中發揮抑癌或致癌作用，如miR-126-3p通過靶向PLXNB2 抑制卵巢癌的增殖和侵襲[10]，miR-27a靶向FOXO1通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進卵巢癌轉移[11]。已有研究表明miR-610在胃癌、肝癌等多種癌癥中低表達，發揮抑癌作用[12-13]。同之前研究相一致，本研究結果顯示miR-610在卵巢癌組織和細胞中低表達，miR-610 高表達降低卵巢癌HO8910細胞劃痕閉合率、減少侵襲細胞數目、上調E-cadherin表達、下調N-cadherin表達，miR-610 低表達結果與之相反。上皮間質轉化是早期卵巢腫瘤向侵襲性和轉移性惡性腫瘤轉化的主要過程，由于上皮特征的喪失和間質特征的獲得，促進了卵巢癌的侵襲性[14]。E-cadherin 和N-cadherin是腫瘤細胞上皮間質轉化的關鍵鈣黏蛋白，其中E-cadherin 具有抑制侵襲的作用，而N-cadherin 具有促進侵襲的作用，它們的表達可直觀地反映癌細胞的遷移和侵襲能力[15]。綜上，miR-610在卵巢癌中發揮抑癌作用，抑制卵巢癌HO8910細胞的遷移和侵襲能力。

MiRNA與靶基因mRNA的3'UTR堿基配對，在轉錄后水平上負調控基因表達的核苷酸長度，從而導致靶基因mRNA 降解或翻譯抑制。為進一步了解miR-610 對卵巢癌的遷移和侵襲能力的作用機制，本研究使用TargetScan 數據庫預測miR-610的靶基因，顯示miR-610與MDM23'UTR區存在結合位點。雙熒光素酶報告實驗顯示，與MDM2-WT+ miR-NC組相比較，MDM2-WT+miR-610組熒光素酶活性顯著降低，說明miR-610與MDM2直接靶向結合。MDM2 基因是位于12q13-14號染色體上的原癌基因，最初是在自發轉化的小鼠成纖維細胞的雙微體染色體上擴增的基因座中發現的[16]。MDM2 包含多個保守的功能域，為MDM2的致癌特性提供了結構基礎。研究表明MDM2 在多種人類腫瘤中過表達，包括肉瘤、白血病、乳腺癌、黑色素瘤和成膠質細胞瘤[17]，并且與癌癥轉移密切相關，導致患者預后差和生存期短[18]。研究表明94%的卵巢癌患者中MDM2 存在過表達，并且高水平的MDM2與卵巢癌的分期和轉移相關[19]。本研究結果顯示MDM2 在卵巢癌組織中高表達。MDM2表達水平受多種致癌和腫瘤抑制途徑的轉錄調控，如miR-379-5p 直接靶向MDM2 抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲[20]。本研究表明，miR-610 通過靶向下調MDM2的表達對卵巢癌細胞侵襲和遷移發揮抑制作用。

綜上所述，miR-610在乳腺癌細胞中低表達，通過靶向下調MDM2的表達來抑制乳腺癌癌細胞的遷移和侵襲能力。這些結果表明miR-610 可作為乳腺癌的新型治療靶標，但其具體的分子通路機制和動物體內實驗還有待進一步研究。