白藜蘆醇聯合順鉑對神經膠質瘤細胞的作用*

閆苗苗 潘效紅 范艷玲 劉文英 魏光成 耿 楓

（濱州醫學院藥學院，煙臺 264003）

神經膠質瘤是一種常見的中樞神經系統的惡性腫瘤，由于其異質性和耐藥性及血腦屏障等因素，多以手術治療為主，傳統化療藥物的治療效果均不理想[1-4]。一些天然化合物具有抗癌活性,但對腫瘤細胞的作用效果不如化學合成藥物[5-6]。本研究應用具有重要生物活性的天然多酚類化合物白藜蘆醇（resveratrol，Res）[7-13]與已經在臨床應用過的順鉑（cisplatin，DDP）聯合用藥，作用于體外培養的神經膠質瘤細胞，比較單獨用藥和聯合用藥的效果，為臨床用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

神經膠質瘤細胞株（C6）來源于本實驗室凍存復蘇的細胞。白藜蘆醇和順鉑購自美國Sigma公司，純度＞99%，配成100 mg/mL貯存液，-20℃備用。細胞增殖檢測試劑盒（Cell Counting Kit，CCK8）、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒和細胞周期試劑盒均購自南京凱基公司；Bcl-2、Bax、p-Erk1/2抗體購自博士德公司；IP細胞裂解液和預染蛋白分子量標準等其它所有試劑均購自江蘇碧云天。

1.2 細胞培養

大鼠神經膠質瘤細胞株（C6）在含有10%新生牛血清的DMEM高糖培養液，于37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞長滿培養瓶的70%～80%，進行消化、傳代、種板。

細胞增殖檢測藥物濃度，白藜蘆醇為0、10 mg/mL 和15 μg/mL；順鉑為0、3.125 μg/mL和6.25 μg/mL；聯合用藥組，白藜蘆醇+順鉑為（0+0）、（10+3.125）、（15+3.125）、（10+6.25）μg/mL 和（15+6.25）μg/mL。

其余檢測選用的藥物濃度為，對照組、白藜蘆醇為10 μg/mL；順鉑為3.125 μg/mL，白藜蘆醇+順鉑為（10+3.125）μg/mL。

1.3 細胞增殖抑制率檢測

細胞接種于96孔板，每孔2×103個細胞，培養24 h后加入不同濃度的藥物，培養24、48、72 h后，每組分別設立對照組，每個濃度設立5個復孔。每孔加入10 μL CCK8的新型細胞增殖及細胞毒性檢測溶液，37℃下繼續在培養箱中培養1～4 h。于450 nm 波長處測定每孔的光密度OD值，計算細胞的增殖抑制率（IR）。

IR=（1-實驗孔A／對照孔A）×100%。

1.4 細胞形態變化

細胞接種于24孔板，每孔2×104個細胞，培養24 h后，加藥作用24 h，棄去培養液，PBS洗2次，每孔加4%的多聚甲醛500 μL室溫固定20 min，吸出固定液，PBS洗1次，每孔加3 μL的吖啶橙染液[14]，搖晃2 min，熒光顯微鏡觀察細胞變化并拍照。

1.5 細胞凋亡檢測

細胞接種于6孔板，每孔2×105個細胞，培養24 h后加入藥物。收集細胞；PBS 洗滌2次后（2 000 r/min離心5 min）；加 入500 μL的binding buffer，5 μL Annexin V-FITC 和5 μL propidium iodide 于細胞懸液中混勻；在1 h內，進行流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡的百分比。

1.6 細胞周期檢測

細胞接種于6孔板，培養24 h后加入藥物24 h后，收集細胞，PBS 洗滌2次后（2 000 r/min離心5 min），加入75%的乙醇4℃固定過夜，后根據DNA含量檢測試劑盒（凱基生物公司）的說明書，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 免疫印跡檢測

細胞刮子收集細胞，4℃，1 500 r/min，離心10 min，棄掉上清，加80 μL RIPA裂解液冰上裂解30～40 min，12 000 r/min離心5 min；取上清液，使用BCA試劑盒進行蛋白濃度的測定，之后加入20 μL 5×上樣緩沖液，95℃煮蛋白，電泳，轉膜，封閉，加入特異性一抗，Bcl-2、Bax、p-Erk1/2 和GAPDH，4℃過夜，漂洗孵育后，加ECL 發光液，化學發光系統照相分析。

1.8 統計學處理

本研究的實驗結果按金正均[15]提出的概率和方法計算Q值判斷兩藥的協同作用[15]。Q=E（A+B）/[EA+（1-EA）×EB]

2 結果

2.1 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞增殖抑制率的影響

結果顯示（表1），白藜蘆醇和順鉑單獨作用時，隨著時間和濃度的增加，對神經膠質瘤細胞（C6）的增殖有明顯的抑制作用；兩者聯合用藥抑瘤作用明顯強于單獨應用白藜蘆醇、順鉑時，按照公式推算，Q＞1.15，兩者之間呈相互協同關系。

2.2 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞形態的影響

不同濃度的藥物作用神經膠質瘤細胞24 h后，結果顯示（圖1）, 白藜蘆醇和順鉑單獨作用時，細胞與對照組比變化不大，而兩者聯合時細胞的數量明顯減少，而且細胞核呈現黃綠色的數量明顯增多,細胞變小變圓，細胞膜有出芽現象。

表1 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞增殖抑制率的影響（±s，%）

表1 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞增殖抑制率的影響（±s，%）

組別 濃度（μg/mL）24 h 48 h 72 h抑制率 Q值抑制率 Q值抑制率 Q值對照組 0 0.00 ±5.38--0.00 ±4.58--0.00±5.26--白藜蘆醇組 10 23.27±2.84--23.05±5.57--31.55±4.57--15 30.51±3.99--31.81±5.72--41.85±5.37--順鉑組 3.125 13.53±3.05--13.56±2.26--16.53±3.07--6.25 29.97±10.10--26.46±6.26--34.19±10.00--白藜蘆醇和順鉑組 10+3.125 57.08±3.42 1.70 63.78±4.37 1.91 67.33±1.01 1.57 10+6.25 64.69±2.17 1.40 63.30±6.27 1.46 69.74±2.75 1.27 15+3.125 62.16±3.20 1.56 65.03±1.96 1.58 75.17±3.51 1.46 15+6.25 67.88±2.90 1.32 68.97±2.26 1.38 86.92±2.62 1.41

2.3 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞凋亡的影響

Annexin V 熒光染色檢測，加入藥物濃度為0、白藜蘆醇10 μg/mL、順鉑3.125 μg/mL、白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL時，正常細胞率分別為98%、91%、81%、67%；從上述數據及圖2 中可以看出，二者聯合應用時，細胞凋亡率高于單獨應用，利用統計學分析兩藥合用效果，Q＞1.15，表明兩者之間呈相協關系，并且明顯強于單獨用藥（P＜0.05）。

2.4 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞周期的影響

對照組、10 μg/mL 白藜蘆醇和3.125 μg/mL 順鉑時，細胞G2期的百分比為11.3%、12.8%、7.9%，S期分別為31.2%、29.3%和31.5%。從這組數據顯示白藜蘆醇和順鉑單獨作用于細胞時，對細胞的增殖周期沒有顯著影響；兩者聯合時，細胞G2期所占的比為0.3%（P＜0.05），S期所占的比為42.9%，提示細胞阻滯在S期，細胞的有絲分裂受到抑制，從而抑制細胞的增殖。

2.5 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞Bcl-2、Bax 和p-Erk1/2表達的影響

神經膠質瘤細胞（C6）在白藜蘆醇、順鉑單獨及聯合作用24 h后，結果顯示（圖4），Bax 和Bcl-2的比值在白藜蘆醇和順鉑兩者聯合應用時明顯變大，而且兩者聯合應用與單獨用藥相比差異有統計學意義（P＜0.05）。p-Erk1/2 光密度比值逐漸下降，蛋白的表達量降低。其中，藥物濃度為白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL時差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。

圖1 神經膠質瘤細胞（C6）形態的變化，標尺=200 μm。A：對照組；B：白藜蘆醇10 μg/mL；C：順鉑3.125 μg/mL；D：白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL.

圖2 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞凋亡的影響。A：對照組；B：白藜蘆醇10 μg/mL C：順鉑3.125 μg/mL；D：白藜蘆醇+ 順鉑（10+3.125）μg/mL.

圖3 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞周期的影響。A：對照組；B：白藜蘆醇10 μg/mL；C：順鉑3.125 μg/mL；D：白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL.

圖4 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞Bcl-2、Bax 和p-Erk1/2表達的影響

3 討論

白藜蘆醇為天然植物補體，在多種腫瘤中可通過多種途徑在腫瘤各階段抑制腫瘤發展[16-21]。但有關白藜蘆醇在神經膠質瘤中的研究報道甚少，本研究將白藜蘆醇作用于神經膠質瘤細胞C6后，顯示其在體外可抑制膠質瘤細胞的生長。順鉑是臨床常用于治療腫瘤的化療藥物，但其副作用很大。本研究將白藜蘆醇與順鉑聯合作用于神經膠質瘤細胞，希望白藜蘆醇協同順鉑使其在低劑量時能夠增強對癌細胞的作用，由于順鉑劑量的減少，從而減輕其副作用。

本研究主要探討白藜蘆醇能否增強順鉑對神經膠質瘤C6細胞的增殖抑制作用。CCK8 檢測的細胞增殖抑制率結果表明白藜蘆醇和順鉑單用藥組可以抑制細胞增殖,并且具有時間和濃度依賴性；聯合用藥兩者存在協同作用（Q ≥1.15）。流式細胞儀檢測進一步證實聯合用藥兩者存在協同作用。

吖啶橙染色，熒光顯微鏡觀察結果顯示細胞在聯合用藥時,細胞的數量明顯減少，細胞核呈現黃綠色的數量明顯增多，細胞的體積變小變圓，細胞膜有出芽現象。

細胞周期檢測結果顯示，當2 者聯合應用時，細胞G2期的比例明顯減少，S期的比例明顯增多。分析細胞可能阻滯在S期，從而抑制細胞的增殖。

經白藜蘆醇和順鉑單獨用藥和聯合用藥處理的C6細胞，與對照組比較，Bax 和Bcl-2的比值在白藜蘆醇和順鉑兩者聯合應用時，可以看出Bax蛋白或蛋白同源二聚體占優勢，細胞凋亡被誘導。表明白藜蘆醇和順鉑誘導C6細胞凋亡是通過調控Bcl-2和Bax 基因表達實現。經白藜蘆醇和順鉑聯合處理的C6細胞，與對照組比較,其p-Erk1/2 基因表達水平降低，差異有統計學意義。因為當Erk1/2 被激活后，表現為磷酸化的活性形式p-Erk1/2，可能是抑制了Ras-Raf-MEK-Erk 信號通路途徑，細胞質中的信號不能正常傳遞到細胞核，或是傳遞到細胞核中的信號是錯誤的，結果影響了正常的核轉錄因子與DNA之間的相互作用，抑制細胞增殖。

總之，白藜蘆醇和順鉑能協同抑制膠質瘤細胞株C6的增殖，在分子水平上即通過調控Bcl-2和Bax 基因表達實現細胞凋亡，又通過Ras-Raf-MEK-Erk 信號通路途徑，抑制細胞的增殖。