MicroRNA-181d-5p通過PTEN參與睪丸支持細胞間緊密連接損傷*

張麗虹 王 鋒 趙小貞 王 瑋

（福建醫科大學人體解剖學系，臨床應用解剖學研究室，腦老化與神經變性疾病福建省高校重點實驗室，福州 350122）

MicroRNA 是真核生物體內一種內源性小分子單鏈RNA，通過與目標mRNA的3'UTR區不完全互補結合形成沉默復合物，抑制靶基因表達。睪丸內緊密連接位于生精小管基底部的支持細胞之間，是血-睪屏障（blood-testis barrier，BTB）最主要的組成部分，主要由3種跨膜蛋白（occludin、claudin、JAM）和外周胞質蛋白（zonula occluden，ZO）構成，最終錨定于細胞內肌動蛋白（actin）骨架系統[1]。研究顯示，能夠引起肌動蛋白骨架系統紊亂的因素同樣會造成緊密連接損傷[2-4]，例如PI3K/Akt信號通路的激活[5-13]及肌動蛋白相關蛋白2/3（actin-related-proteins 2/3，Arp2/3）非正常地活化及轉移等[14]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一種非受體型酪氨酸激酶，可與緊密連接處的occludin 或ZO-1 等蛋白復合物結合[6，15]，并通過轉變其不同位點的磷酸化形式參與緊密連接調控[16-19]，影響分枝狀肌動蛋白骨架系統的成核及聚合過程[20-22]。人第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homology deleted from chromosometen，PTEN）是一種具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼的蛋白既可以作為脂質磷酸酶抑制PI3K/Akt信號通路激活，又可以作為蛋白磷酸酶使FAK的第397位酪氨酸發生去磷酸化，降低p-FAK-Tyr397水平[23]。本研究主要探討miR-181d-5p 是否可以與PTEN mRNA的3'UTR區相互作用，并降低其表達，通過升高p-FAK-Tyr397水平以及激活PI3K/Akt信號通路影響肌動蛋白骨架系統穩態，造成緊密連接損傷。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEN/F-12、PBS（HyClone公司）；胎牛血清（BI公司）；PTEN、FAK、p-FAK-Tyr397、Akt、p-Akt-Thr308、β-actin兔抗鼠多克隆抗體（Cell Signaling公司）；Lipofectamine 2000試 劑（Invitrogen公司）；Opti-MEMⅠ、0.25%Trypsin-EDTA、DMSO、Penicillin-Streptomycin（Gibco公司）；Dual-Luciferase Report Assay試劑盒（Promega公司）。

1.2 雙熒光素酶報告基因分析實驗

1.2.1 質粒構建 本實驗所用質粒購買于吉凱基因公司，分別為miR-181d-5p NC空白對照質粒、miR-181d-5p過表達質粒、重組PTEN mRNA 3'UTR野生型熒光素酶報告質粒（PTEN-3'UTR-wt）、重組PTEN mRNA 3'UTR 突變型熒光素酶報告質粒（PTEN-3'UTR-mut）、內參海腎熒光素酶報告質粒。

1.2.2 細胞培養及分組 293T細胞采用常規細胞完全培養基培養，條件為37℃、5%CO2及飽和濕度。選對數生長期細胞進行實驗。設置4個實驗組，分別為PTEN-3'UTR-wt+miR-181d-5p NC組、PTEN-3'UTR-wt+miR-181d-5p組、PTEN-3'UTRmut+miR-181d-5p NC組、PTEN-3'UTR-mut+ miR-181d-5p組。每組設6個復孔，各組質粒轉染48 h后，進行熒光檢測，具體操作過程按照雙熒光素酶報告基因分析系統發光試劑盒說明書進行。

同時在293T細胞上采用質粒單純過表達miR-181d-5p，設置2個實驗組，分別為293T+miR-181d-5p NC空白對照組（293T+miR NC組）和293T+miR-181d-5p過表達實驗組（293T+miR組），每組設6個復孔。

1.3 TM4細胞過表達miR-181d-5p及細胞間跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TER）值測定

1.3.1 MicroRNA mimic構建由于TM4細胞對質粒的轉染效率不高，因此miR-181d-5p過表達采用microRNA mimic（吉瑪基因生物公司）進行，分別設為miR-181d-5p NC空白對照mimic 和miR-181d-5p過表達mimic。

1.3.2 細胞培養及分組 小鼠睪丸支持細胞TM4細胞購買于ATCC公司，采用常規細胞完全培養基培養，條件為37℃、5%CO2及飽和濕度，選擇對數生長期細胞進行實驗。設置2個實驗組，分別為TM4+miR-181d-5p NC空白對照組（TM4+miR NC組）和TM4+miR-181d-5p過表達實驗組（TM4+miR組），每組設6個復孔。各組mimic轉染48 h后，進行相關信號分子和TER值測定。

1.3.3 TER值測定 使用Millicell ERS 電阻儀測定TM4細胞間TER值，在24孔板中放入插入小室測定，每組設6個復孔，具體操作過程參照儀器使用說明書，測定的單位面積電阻值的計算方法為：單位面積電阻值（Ωcm2）=電阻值（Ω）×有效跨膜面積（cm2）（24孔板的有效跨膜面積值為0.6 cm2）。

1.4 免疫印跡檢測

24孔板轉染后48 h，采用細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。制備SDS 聚丙烯酰胺凝膠，并進行電泳分離，每孔上樣量為20 μL，總蛋白上樣量約為40 μg。轉膜及脫脂奶粉封閉1 h后，采用一抗4℃孵育過夜（PTEN、FAK、p-FAK-Tyr397、β-actin稀釋倍數為1：500，Akt和p-Akt-Thr308為1∶200），HRP標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，洗膜，ECL發光，分子生物學發光儀拍攝，Image J 軟件計算條帶灰度值，并計算各目的蛋白的相對表達量。

1.5 統計學處理

采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料采用±s表示，采用單因素ANOVA 分析及Tukey 法進行多重比較，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MiR-181d-5p可以與PTEN mRNA 3'UTR區結合，并降低其表達

雙熒光素酶報告基因分析顯示，質粒轉染293T細胞的效率為60%～70%（圖1A～D）。PTEN-3'UTR-wt+miR-181d-5p組的相對熒光值比率低于其他組（P＜0.05）（圖1E、F），證明miR-181d-5p可以與PTEN mRNA 3'UTR區結合。免疫印跡檢測結果顯示，293T細胞過表達miR-181d-5p后（圖2A、B），PTEN蛋白表達降低（P＜0.05）（圖2C）。

圖1 雙熒光素酶報告基因分析各組質粒轉染效率，標尺=100 μm

圖 2 各組在293T細胞過表達miR-181d-5p 效率及PTEN蛋白表達，標尺=100 μm

2.2 TM4細胞過表達miR-181d-5p 引起TER值降低

結果顯示，microRNA mimic 轉染TM4細胞的效率為30%～35%（圖3A、B）。TM4細胞過表達miR-181d-5p后PTEN蛋白水平降低，p-Akt-Thr308和p-FAK-Tyr397水平升高（P＜0.05）（圖3C、D），但Akt 及FAK表達水平沒有變化。TM4細胞間相對TER值（0.70±0.15）降低。

圖3 各組小鼠睪丸支持細胞TM4細胞過表達miR-181d-5p 效率及各蛋白表達，標尺=100 μm

3 討論

3.1 MiR181d-5p通過與PTEN mRNA 3'UTR結合降低PTEN蛋白表達

近年來研究顯示，microRNA 無論是在生理還是病理條件下均發揮重要作用，不僅參與眾多生物學過程，同時與疾病的發生和發展密切相關[24-25]。MicroRNA可通過與mRNA的3'UTR區不完全互補結合，進一步誘導mRNA的降解、切割及翻譯抑制等過程，抑制靶基因的表達。本研究主要基于前期精索靜脈曲張動物模型的研究結果開展，通過對睪丸組織進行microRNA測序、篩選及驗證實驗，顯示精索靜脈曲張會引起左側睪丸組織內miR-181d-5p表達升高以及緊密連接結構和功能的的損傷[26]。通過查閱相關網站（http：//www.targetscan.org/vert_71/）發現，PTEN mRNA的3'UTR區存在3個潛在可以與miR-181d-5p結合的位點（核苷酸序列為TGAATGT，分別為2261～2267位、2468～2474位和2675～2681位）。通過生物信息學分析，推測精索靜脈曲張引起的miR-181d-5p表達水平升高，可能參與了睪丸內緊密連接損傷過程，并可能是通過降低PTEN的表達實現，但具體機制尚未明確。因此，設計本實驗的目的是驗證miR-181d-5p 是否可以與PTEN mRNA的3'UTR區結合，并降低其表達，通過PTEN 參與睪丸支持細胞間緊密連接的損傷過程，試圖從microRNA層面闡述緊密連接動力學調控及損傷機制。本研究結果證實miR-181d-5p可以與PTEN mRNA的3'UTR區結合，且293T細胞過表達miR-181d-5p后可引起PTEN蛋白表達降低。

3.2 PTEN 水平降低造成睪丸支持細胞間緊密連接損傷的機制

PTEN 是一種具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因，與腫瘤的發生和發展密切相關。在本實驗中，miR-181d-5p通過降低PTEN表達參與緊密連接損傷的機制可能主要涉及以下兩個方面。

首先，PTEN作為脂質磷酸酶可以抑制PI3K/Akt信號通路的激活，它可使該信號通路的第二信使phosphatidylinositol（3，4，5）-trisphosphate（PIP3）發生去磷酸化轉變為phosphatidylinositol（4，5）-bisphosphate（PIP2），從而抑制下游信號分子激活。PI3K/Akt信號通路的激活可通過擾亂肌動蛋白骨架系統穩態造成緊密連接損傷，而給予PI3K/Akt信號通路阻斷劑，能夠減輕由生殖毒性物質或其他理化因素造成的緊密連接損傷[5-13]。基于本實驗結果，推測由miR-181d-5p過表達引起的PTEN表達水平降低，進一步激活PI3K/Akt信號通路，參與緊密連接損傷過程。此外，研究顯示PIP2在細胞膜上的含量需＞5%，才可啟動正常地由WASP（Wiskott-Aldrich syndrome protein）家族蛋白和Arp2/3 介導的肌動蛋白成核和聚合過程[27]；PIP3可通過激活Rho 小GTPase家族蛋白調控肌動蛋白骨架系統[28]。因此，推測PTEN 還可能通過改變PIP2和PIP3的濃度及定位，參與緊密連接損傷，但仍需進一步的實驗證實。

其次，PTEN作為蛋白質磷酸酶，可以與FAK的第397位酪氨酸位點直接結合，并引起該位點去磷酸化[23]。FAK在睪丸組織內可定位于緊密連接處，與occludin或ZO-1等復合物結合，通過轉變其不同位點的磷酸化形式（例如p-FAK-Tyr397、p-FAK-Tyr407、p-FAK-Tyr576）[16-19]參與緊密連接調控。Arp2/3是介導分枝狀肌動蛋白細胞骨架成核和聚合的關鍵蛋白，FAK可以與Arp2/3結合，并增加Arp2/3的活性；而FAK 第397位酪氨酸磷酸化會消減其與Arp2/3之間的相互作用，影響Arp2/3 正常地活化及轉移過程，間接造成緊密連接損傷[20，22]。此外，p-FAK-Tyr397水平升高還能進一步促進PI3K/Akt信號通路的激活[29]。因此，由PTEN表達降低引起的p-FAK-Tyr397水平增高及PI3K/Akt信號通路激活并不是兩個完全孤立的生物學過程，兩者之間密切聯系，相輔相成又相互促進，共同參與緊密連接損傷。

綜上所述，miR-181d-5p可能通過降低PTEN表達，導致p-FAK-Tyr397水平升高以及激活PI3K/Akt信號通路，參與緊密連接損傷。由于本實驗的結果均來自體外實驗，存在一定局限性，而緊密連接的動力學調控涉及非常復雜的生物學過程，PTEN 參與緊密連接損傷的確切機制還需要更為詳盡的實驗證實。