滯育期九香蟲卵巢組織蛋白的LC-MS/MS鑒定

郭建軍 田瑩 檀軍 金道超

摘 要：九香蟲的越冬滯育是影響其大規模人工繁殖的桎楛，保幼激素可調控九香蟲的滯育，并可促進卵巢發育。為探索滯育期九香蟲卵巢組織蛋白的組成，本研究提取滯育期與滯育解除期的九香蟲卵巢組織蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行初步分析，液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）對胰酶消化產生的肽段混合物進行分析。結果表明，質譜共檢測到448條肽段，唯一肽段為341條，分布于205種蛋白中，分子量集中在10～60 kDa，其中，保幼激素結合蛋白、過氧化氫酶、ATP酶、精氨酸激酶、熱休克蛋白及相關同源蛋白的表達可能與九香蟲滯育期的越冬抗逆性、調控生長發育、能量代謝及維持滯育有關。

關鍵詞：九香蟲;滯育;卵巢;LC-MS/MS;蛋白鑒定

Abstract：The overwintering diapause of Aspongopus chinensis Dallas affected their large-scale artificial reproduction，juvenile hormone could regulate the diapause of of A.chinensis and promote the development of ovarian.In order to explore the composition of the ovarian tissue proteins during the diapause period，this study extracted the ovarian tissue proteins during the diapause and diapause termination period.Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel （SDS-PAGE） was used for electrophoresis analysis，and the peptides digested by trypsin were analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）.The results showed that mass spectrometry detected a total of 448 peptide，the number of unique peptide was 341，which were distributed in 205 kinds of proteins，and the molecular weight of these proteins ranged from 10 to 60 kDa.The expression of juvenile hormone binding protein，catalase，ATPase，arginine kinase，heat shock protein and related homologous proteins may be related to the resistance to overwintering，growth，development，energy metabolism and maintenance of diapause in A.chinensis.

Keywords：aspongopus chinensis dallas;diapause; ovary; LC-MS/MS;protein identification

九香蟲（Aspongopus chinensis Dallas）是昆蟲綱半翅目兜蝽科昆蟲[1-2]，也是《本草綱目》收錄的傳統中藥，其具有理氣止痛、溫中助陽、抗癌、抗菌、抗凝血的功效[3-7]。九香蟲血淋巴、水提液、水煎液、甲醇提取物及純化蛋白等可抑制胃癌及乳腺癌細胞的體外增殖。近年來，隨著人工大規模采集及環境污染，野外九香蟲產量逐漸減少，九香蟲的市場價格逐年攀升，常供不應求。因此，亟需人工養殖以解決野外蟲源不足的問題[8]。

九香蟲為不完全變態昆蟲，有卵、若蟲和成蟲3個蟲態，其中，卵歷期8～10 d，一至五齡若蟲共歷期80～101 d，成蟲壽命約為320～350 d，滯育期高達約210 d，九香蟲的越冬滯育現象嚴重制約了其大規模人工繁殖[9-11]。滯育是一種復雜的生理過程，昆蟲在滯育期，其體內的蛋白、多糖、脂類等代謝會發生相應的變化，降低新陳代謝速率，以度過不良環境，保留種群[12]。滯育期九香蟲總蛋白含量較高，但其種類尚不明確[13];此外，保幼激素可調控九香蟲的滯育[14]，其在昆蟲的咽側體中產生，可促進卵巢發育[15]，且滯育期與滯育解除期的九香蟲卵巢在形態上存在差異[9]，那么，在滯育期的九香蟲卵巢中是否存在與滯育或抗逆性等相關的蛋白？為探究上述問題，本研究采集滯育期與滯育解除期的九香蟲，提取卵巢組織蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳進行初步分析，用胰蛋白酶消化產生肽段混合物，采用液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）對肽段進行分析，探索滯育期九香蟲卵巢組織蛋白的組成，為九香蟲的人工繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

滯育期九香蟲成蟲，于2017年12月采集自貴州省遵義市習水縣 （E 106°10′，N 28°09′），并儲存于-80℃冰箱備用;滯育解除期九香蟲于2018年5月采集自上述同樣的地點，在人工氣候箱中飼養，溫度（28±1）℃，濕度（85±5）%，光照周期16L∶8D，以觀察到交配的發生為滯育解除的標準。

1.2 主要試劑

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（貨號：P0012A）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×，貨號：P0015）、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0006）、蛋白酶抑制劑混合物（通用型，100×，貨號：P1005）、RIPA裂解液（強，貨號：P0013B）、考馬斯亮藍R-250（貨號：ST1123）均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 Bradford法檢測九香蟲蛋白含量

采用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋牛血清白蛋白（BSA）標準品，配制0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5 mg/mL BSA標準液，參照Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書制作蛋白標準曲線。取滯育期與滯育解除期九香蟲卵巢組織，液氮研磨，加入150 μL RIPA裂解液，于冰浴上裂解10 min，取5 μL九香蟲蛋白樣品，加到96孔板中，再加入250 μL G250染色液，設置4個復孔，用酶標儀（Multiskan FC型，美國Thermo Fisher Scientific公司）測定595 nm處吸光度值，根據上述制作的蛋白標準曲線計算滯育期與滯育解除期九香蟲卵巢組織的蛋白濃度。

1.4 SDS-PAGE檢測九香蟲蛋白

配置SDS-PAGE膠（5%濃縮膠，15%分離膠），向蛋白樣品中加入1/4體積的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×），沸水浴煮沸5 min，12000 g離心5 min，根據上述檢測的蛋白濃度，調整蛋白上樣量加入電泳孔中，因滯育期與滯育解除期蛋白濃度相差太大，故使上樣量組內3個復孔一致。80 V電泳30 min，待蛋白進入分離膠，120 V繼續電泳1 h，待指示劑條帶離底部1 cm時停止電泳。考馬斯亮藍R-250染色30 min，洗脫液洗脫2 h，每30 min換一次洗脫液，直至條帶清晰，采用蛋白凝膠成像系統（SYSTEM GelDoc XR+，美國Bio-Rad公司）拍照。

1.5 LC-MS/MS分析滯育期九香蟲蛋白組成

對滯育期九香蟲蛋白條帶進行膠條LC-MS/MS分析，樣品預處理及LC-MS/MS檢測參照Tan等的實驗方法進行[4]，具體操作簡述如下，切下膠條（如圖1所示），用400 μL 50 mM 的NH4HCO3/ACN（50% v/v）洗滌兩遍;0.05 μg/μL胰蛋白酶25℃恒溫水浴酶解12 h，冷凍干燥。采用TripleTOF 5600質譜儀（AB SCIEX，Framingham，US），結合Eksigent UPLC425液相色譜系統進行LC-MS/MS分析，使用C18柱（150 mm×75 μm，3 μm）進行高效液相色譜分離，采用Protein Pilot 4.5（AB SCIEX，Framingham，US）軟件分析，結合UniProt （https：//www.uniprot.org/）蛋白質數據庫進行搜庫分析。

2 結果與分析

2.1 滯育期九香蟲蛋白含量及組成分析

Bradford法制作的蛋白標準曲線方程為Y=0.3414X+0.5284（R2=0.9699），根據蛋白標準曲線，結合樣品檢測的吸光度值（OD值），計算滯育期與滯育解除期的九香蟲蛋白含量分別為1.226±0.031、0.113±0.009 μg/μL。SDS-PAGE蛋白電泳檢測結果顯示，滯育解除期的九香蟲蛋白條帶較少，滯育期九香蟲蛋白條帶較多，主要集中在10～60 kDa（虛線方框所示），其中，10、15、25、66 kDa附近的條帶較明顯。以上結果表明，滯育期九香蟲蛋白條帶較豐富，可滿足后續LC-MS/MS實驗要求。

2.2 肽段的LC-MS/MS分析

LC-MS/MS檢測結果顯示，滯育期九香蟲卵巢組織蛋白經液相色譜分離后，在質譜中檢測到的肽段數量與豐度較高（圖2），共檢測到448條肽段，其中唯一肽段為341條，分布于205種蛋白中。在所有搜庫所得到蛋白中，唯一肽段數主要集中在1～2條，少數蛋白的唯一肽段高達17條。對蛋白理論分子量數據進行分析發現，大多數蛋白的分子量分布在10 kDa～60 kDa，與SDS-PAGE檢測結果基本一致（圖3）。以MS/MS數據搜庫比對的唯一肽段數量、覆蓋率、準確率得分等為指標，結合九香蟲滯育期的相關生物學現象，本研究篩選到25種具有功能注釋的高可信度蛋白，其中，保幼激素結合蛋白（Juvenile hormone binding protein）可能與九香蟲滯育相關;熱休克蛋白家族成員Hsp 60、Hsp 70及相關同源蛋白的高表達可能與九香蟲在滯育期間的越冬抗逆性有關[16];過氧化氫酶（Catalase）的高表達有利于增強滯育期九香蟲的防御功能;ATP酶（ATP synthase）、精氨酸激酶（Arginine kinase）等可能與調控九香蟲滯育期的能量代謝相關[17]。此外，在所鑒定的卵巢組織蛋白中仍有大量未知名稱及功能的蛋白（表1）。

3 結論與討論

隨著人工大規模采集、農藥的使用及野外環境的惡化，野外九香蟲的數量逐年驟減，市場供不應求的現象近年來愈加明顯，人工養殖是解決九香蟲野外種群數量不足的重要途徑，但九香蟲存在越冬滯育現象，嚴重制約了這一藥食兩用昆蟲資源的大規模人工繁殖[8]。本文在長期（2012年—至今）進行九香蟲人工繁育行為研究的基礎上，首次對滯育期九香蟲卵巢組織蛋白的含量及組成進行分析，發現滯育期九香蟲卵巢組織蛋白含量及條帶較豐富。其中，保幼激素結合蛋白可能與九香蟲滯育相關。研究表明，保幼激素結合蛋白可與保幼激素相作用，保幼激素在昆蟲咽側體中產生，可促進卵巢發育，并調控昆蟲的生殖、發育[15]。保幼激素可調控九香蟲滯育;類似研究結果顯示，滯育期二化螟幼蟲血淋巴的保幼激素含量比非滯育幼蟲的高;保幼激素處理可促使柞蠶Antherea pernyi、三帶喙庫蚊Culex tritaeniorhynchus解除滯育。此外，在滯育期九香蟲卵巢組織蛋白中還鑒定到大量熱休克蛋白家族成員（Hsp 60、Hsp 70等），研究表明，昆蟲在受到熱激或冷激等環境刺激時，體內可能會產生熱休克蛋白，以提高昆蟲的抗逆性;熱休克蛋白在大多數蠅類、舞毒蛾Lymantria diapar、竹蠹螟Omphisa fuscidentalis、二化螟Chilo suppressalis等昆蟲的滯育期表達均高于滯育解除期[16]。九香蟲9～10月尋找越冬場所越冬，次年的5～6月陸續交尾，越冬期間調查點的氣溫較低、食物短缺[9]，本研究所發現的滯育期九香蟲卵巢組織大量表達ATP酶、過氧化氫酶、精氨酸激酶等可能與調控九香蟲滯育期的能量代謝速率相關，滯育在九香蟲野外度過低溫、食物短缺等不良環境中具有重要作用。

綜上，為探究九香蟲滯育期卵巢組織蛋白的含量、組成，本研究首次通過LC-MS/MS對滯育期九香蟲卵巢蛋白酶解肽段進行分析，共檢測到448條肽段，唯一肽段為341條，分布于205種蛋白中，分子量大多分布在10～60 kDa，其中，保幼激素結合蛋白、熱休克蛋白及相關同源蛋白、過氧化氫酶、ATP酶、精氨酸激酶的表達可能與九香蟲在滯育期間的越冬抗逆性、調控生長發育、能量代謝及維持滯育有關。但是，在所鑒定的卵巢組織蛋白中仍有大量未知名稱及功能的蛋白，這些蛋白的高表達也可能在九香蟲滯育中發揮作用，尚需進一步研究。

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