彌河沉積物的反硝化和厭氧氨氧化過程

李佳霖,秦 松

彌河沉積物的反硝化和厭氧氨氧化過程

李佳霖1,2,秦 松1,2*

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所海岸帶生物學與生物資源保護實驗室,山東 煙臺 264003；2.中國科學院海洋大科學研究中心,山東 青島 266071)

本研究選取彌河4個站點為研究對象,在不同季節分別采集沉積物樣品,測定理化指標,并采用同位素配對技術和分子生物學方法,研究了沉積物中的反硝化和厭氧氨氧化作用及其影響因素.結果表明,彌河沉積物中的反硝化速率變化范圍為151.75~2847.86μmol/(m2×h),厭氧氨氧化速率的變化范圍為149.57~2109.17μmol/(m2×h),厭氧氨氧化在氮去除中的貢獻量平均達到56.1%.沉積物中的反硝化細菌以K型為主,豐度為0.19×106~5.12×106個/g,主要是-和-變形菌門;厭氧氨氧化細菌以A為標記基因的豐度范圍是2.58×102~1.14×104個/g,主要為浮霉菌門的屬細菌.反硝化速率與沉積物中的TN含量和間隙水PO43-呈正相關關系,厭氧氨氧化作用與沉積物中的TN含量呈正相關,而與沉積物密度呈負相關關系,沉積物的理化指標是決定氮去除速率的主要環境條件.彌河的反硝化和厭氧氨氧化作用明顯,對減輕氮超標具有重要意義,合理改變沉積環境是有效提高氮去除速率的可參考方式.

反硝化作用；厭氧氨氧化作用；功能微生物；影響因素；彌河

受人類活動的影響,世界范圍內的近海入海河流普遍存在無機氮污染的環境問題.根據美國環境保護署2012年的調查報告,全美河流41%的河段氮含量較高;在我國實施監測的55條入海河流中,過半數河流入海斷面水質劣于V類地表水水質標準,主要污染要素中包括氨氮[1].無機氮污染不僅會造成區域性河流的富營養化,而且隨河流入海后將產生近海海域嚴重的生態問題,如生物多樣性降低、發生有害藻華甚至出現低氧“死區”[2-3].無機氮污染主要來源于非點源的農業化肥,由于未能有效利用,全球超過一半的施用化肥排入河流,而隨著糧食需求及施肥強度的加大,未來全球范圍內排入河流的氮總量仍將增加[4],因此對河流生態系統中無機氮的生物地化循環進行研究具有重要意義.

微生物介導的無機氮生物地化循環過程包括固氮、硝化、硝酸鹽異化還原成銨、反硝化和厭氧氨氧化等作用[5].其中,河流的反硝化和厭氧氨氧化過程將無機氮轉化為氮氣和氧化亞氮,可以實現流域中無機氮的去除,既是計算氮循環通量的關鍵內容,也是潛在治理氮富營養化、實現生態修復的有效途徑.反硝化和厭氧氨氧化是厭氧反應過程,普遍存在于水體懸浮顆粒物、沉積物環境中,在河流中去除氮的貢獻量達到40%~80%[6].利用同位素配對技術對反硝化和厭氧氨氧化進行測定,發現多數河流沉積物的反硝化作用占主要貢獻量[7-9],但隨著無機氮濃度的升高,提供反硝化作用所需電子的有機物相對不足,厭氧氨氧化作用會成為無機氮去除的主要過程[10].研究發現河流中的環境因子,包括鹽度、無機氮、有機質、沉積物的理化特征與反硝化和厭氧氨氧化速率均存在相關性[11-13];同時由于是微生物介導的過程,反硝化和厭氧氨氧化細菌的豐度和多樣性能夠直接影響反應速率[14-16].由于河流的環境條件變化較大,反硝化和厭氧氨氧化速率及其主要的影響因素也存在明顯差異.

彌河是萊州灣南岸的主要入海河流之一.受溫帶季風氣候冷暖氣流的影響,彌河具有我國北方河流的顯著特點,即春秋旱易形成斷流現象、夏季降雨較多流量激增、冬季少雪存在冰期.由于常年開采地下水用于城市供水及農業生產,造成流域內大范圍的地下水超采,彌河中下游的咸水入侵較為嚴重,河水的鹽度尤其是在旱季有顯著升高[17].彌河上游的壽光是北方重要的蔬菜生產基地,中下游流經化工產業園,大量工農業含氮污水及沿岸生活污水造成彌河的氮污染較高[18].彌河入海后匯入萊州灣,萊州灣尤其是西部海區水體呈現嚴重的氮富營養化狀態,其主要的來源是沿岸河流的輸入[19].本研究通過對彌河沉積物的反硝化和厭氧氨氧化過程向河水中釋放氮氣通量的研究,探討了其對流域氮循環過程的影響;同時對沉積物中反硝化和厭氧氨氧化功能菌群的豐度和多樣性進行分析,結合環境因子,評估了影響沉積物反硝化和厭氧氨氧化速率的影響因子.本研究結果深化了河流中對氮自去除過程的認識,有助于實現氮收支的核算,為河流富營養化的生態治理和修復提供科學參考.

1 材料與方法

1.1 研究站位與樣品采集

彌河主要的環境問題是咸水入侵和氮富營養化,咸水入侵造成沉積物生境的顯著變化.根據咸水入侵范圍[17]和主要陸源污染輸入地域,沿彌河選取4個采樣站位,分別位于鹵水區的彌河橋下(M1)、咸淡水混合區的南半截河村(M2)、張家北樓村(M3)和入侵范圍外的壽光市內(M4),于2012年4月、8月和10月進行了春、夏和秋季的調查和采樣(圖1).由于采樣年份冬季彌河存在冰期,本研究未對彌河進行冬季的研究.

沉積物樣品采集于河邊淺水浸沒區,采取多點取樣法.用有機玻璃柱(長度20cm,直徑3.4cm)采集表層5cm沉積物柱樣,每個站位采集12個平行樣,上下部用膠塞塞好;采集采樣點原位水2.0L,用0.22μm濾膜過濾水樣后裝入滅菌廣口瓶中,于4℃保溫箱保存帶回實驗室,用于反硝化和厭氧氨氧化通量測定培養實驗[20].用無菌針筒采樣管采集表層5cm沉積物保存于4℃保溫箱,用于間隙水營養鹽、孔隙度、密度、含水量、有機碳、總氮和粒度測定,采集表層5cm沉積物保存于液氮中帶回置于-80℃冰箱中,用于功能群落豐度和多樣性分析[21].

圖1 采樣點分布

★為采樣點

1.2 環境因子測定

河水的溫度、鹽度和pH值在采樣現場用YSI556MPS采集數據.密度和含水率采用稱量法測定.沉積物粒度采用激光粒度儀直接測定(Matersizer 2000F laser particle size analyzer, Malvern, England). 間隙水經離心采集后用連續流動分析儀(AAA3, Seal Analytical GmbH, German)的標準方法進行測定[22].元素分析儀 (Elementar, Vario Micro, German)用于測定沉積物的有機碳和總氮.重金屬含量采用ICP-MS (PerkinElmer, Elan DRC II, Hong Kong)測定.所有環境參數進行3個重復測定,結果取平均值.

1.3 反硝化與厭氧氨氧化速率測定

反硝化和厭氧氨氧化速率采用同位素配對技術通過培養實驗的方法進行測定.將采集的沉積物帶回實驗室后插入培養箱中,在有機玻璃管內注滿原位采集的上覆水,密封平衡24h.將培養管分為2組,每組6個,室溫下培養,分別加入125和250μL的Na15NO3溶液(0.1mol/L,99.5%15N,Sigma),培養管用帶磁轉子的膠塞封住,在磁轉子60r/min條件下放置0.5h使15NO3－在培養體系中均勻分布.培養0時刻,在對照組6個培養管中加入0.5mL的ZnCl2(50%,/)溶液,培養3h后,在對照組6個培養管中加入0.5mL ZnCl2溶液,混勻后取上層泥漿樣品12.5mL放入容量瓶(Labco, UK),加入100μL ZnCl2溶液密封保存.培養樣品中的28N2、29N2和30N2含量比值利用氦氣頂空平衡法抽取出頂空氣體,采用穩定同位素質譜儀(Gasbench-MAT253, Thermo Fisher, USA)測定[20],計算公式如下[23]:

式中:是不同濃度15NO-添加體系中15NO-濃度的比值;29N2是29N2-N生成量,μmol;30N2是30N2-N生成量,μmol;(1)和(2)分別表示加入125和250μL Na15NO3的培養體系;14是還原體系中14NO-/15NO-的比值;14是N2-N實際生成量,μmol;28是厭氧氨氧化作用生成的28N2的量,μmol;28是反硝化作用生成的28N2的量,μmol.

1.4 功能微生物豐度與多樣性

稱取0.50g沉積物樣品,用土壤DNA提取試劑盒(Mobio, USA)提取DNA,并將平行的3個樣品混合后進行后續PCR反應.用反硝化細菌亞硝酸鹽還原酶的編碼基因S和K及厭氧氨氧化功能基因片段A的特異性引物進行片段擴增,引物及反應條件見表1.用絕對實時定量PCR方法測定樣品中的功能基因豐度,并以沉積物濕重計量.用變性梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳法對功能菌群多樣性進行聚類分析,選取樣品用克隆建庫方法分析功能基因的群落結構和組成.功能基因序列提交NCBI數據庫,S和K的序列號分別為MT532558 - MT532658和MT532681 - MT532729,A的序列號為MT532659 - MT532680.測定的功能基因序列通過Mothur采用最遠鄰算法進行操作分類單元(OTU)分類,翻譯為相應的氨基酸序列,與GenBank數據庫中相關氨基酸的近似序列進行比對,并采用最大似然法用Mega-X構建系統發育樹.

表1 反硝化和硝化作用功能基因片段引物序列信息

1.5 統計分析方法

單因子方差分析用于檢驗環境因子、功能菌群豐度及氮去除速率是否存在顯著性差異,<0.05表示兩者間存在差異,<0.01表示兩者間存在顯著性差異.采用皮爾遜相關系數衡量變量間的線性關系.通過多元回歸方法分析上覆水、沉積物和間隙水的理化性質及功能細菌豐度對反硝化作用和厭氧氨氧化作用變化的影響[28-29].

2 結果與討論

2.1 彌河主要環境因子

環境條件通過影響微生物的種群豐度和結構,制約生化反應速率,進而影響微生物參與的生物地化循環作用過程.彌河樣品環境因子數據見表2,各因子在站位和季節間存在較大差異.研究站位上覆水的鹽度顯示,彌河研究河段盡管處于咸水入侵區附近,但鹽度相比于同樣處于咸水入侵區的小清河(2.73‰)和膠萊河(7.96‰)偏低[30];所有樣品的pH值均偏堿性,平均值為8.57.沉積物間隙水中無機氮NH4+-N和NO3--N含量均值為0.534和0.397mg/L, NH4+-N含量隨季節變化較大,春季明顯較高; PO43-P的含量較低,與無機氮的濃度相比差異明顯偏低,是沉積物生態環境的主要限制因子;沉積物中重金屬含量較高,按重金屬的物質的量濃度比較,Zn的濃度最高,其次是Cu, Pb和Cr的濃度較低.

彌河處于明顯的季風氣候區,夏季雨水充沛,徑流量上升,上覆水鹽度夏季偏低,但站位間和季節間的環境因子差異并不顯著.

表2 站點上覆水、沉積物和間隙水的物理化學性質

2.2 反硝化和厭氧氨氧化速率

如圖2所示,彌河的反硝化速率范圍為151.75~ 2847.86μmol/(m2×h),均值為680.83μmol/ (m2×h),季節間差異較為顯著(=0.02,=7.39),春季的反硝化速率明顯較高,平均達到1512.58μmol/(m2×h),夏秋季則相對較低.厭氧氨氧化速率范圍為149.57~ 2109.17μmol/(m2×h),均值為898.32μmol/(m2×h),也表現出較為顯著的季節間差異(=0.04,=6.01),春季最高,夏季較高,秋季則最低.彌河厭氧氨氧化在氮去除中的貢獻量是42.5%~78.0%,平均達到56.1%,說明在彌河的無機氮去除過程中,厭氧氨氧化過程與反硝化過程的貢獻量相當,兩者都是氮去除的重要過程.

反硝化作用是在厭氧條件下NO3-經多步反應依次還原為NO2-、NO、N2O,最終生成N2(或不完全反應條件下終產物為N2O)的過程.彌河的反硝化作用速率與三峽庫區小江支流泄水期的速率相當[647.20μmol/(m2×h)],與小江支流蓄水期的速率[24.04μmol/(m2×h)]和淀山湖區的速率[14.60μmol/ (m2×h)]相比較高[31-32];對全球河流沉積物的反硝化作用估算范圍是100.00~685.71μmol/(m2×h)[33],與之相比彌河的反硝化作用速率春季明顯偏高,夏秋兩季處于正常范圍內.彌河的厭氧氨氧化速率經沉積物密度值換算后均值約為11.2nmol/(g×h),與長江口低鹽度河域[0.23nmol/(g×h)]和美國的Cape Fear河的速率[0.17~4.77nmol/(g×h)]相比偏高[34-35].而白洋淀河畔的速率是7~20nmol/(g×h),與彌河速率相當.彌河較高的厭氧氨氧化速率造成其相對貢獻量也較高,而珠江河口、白洋淀河畔和法國的Seine灣厭氧氨氧化過程的貢獻量分別是3.8%~7%[7],11%~ 35%[8]和3%~8%[9],其氮去除過程均以反硝化過程為主.厭氧氨氧化過程的貢獻量較高可能與河水沉積物中NO3-含量較高,而有機碳含量相對不足有關[36].

2.3 反硝化細菌豐度與功能基因多樣性

亞硝酸鹽還原為NO既是反硝化過程的重要限速步驟,也是反硝化過程區別于其它硝酸鹽代謝的標志性反應,其功能酶即亞硝酸鹽還原酶(Nir)包括K和S,分別是銅型亞硝酸鹽還原酶和細胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶,是反硝化微生物的重要分子標志物[37].彌河的反硝化細菌豐度如圖3(a)所示,其中K型豐度范圍是0.19× 106~5.12×106個/g,均值為1.38×106個/g;S型豐度范圍是7.19×103~2.23×105個/g,均值為8.41× 104個/g.反硝化細菌以K型為主,豐度約是S型的16倍.一般較淺的河流中K型反硝化菌是主要類群,而湖泊和海灣中S型反硝化細菌則是主要類群[31],主要原因是S反硝化細菌對環境因子的變化更敏感,河流出現斷流現象造成的表層沉積物條件的改變,以及河流氮富營養化造成的相對磷限制,會顯著影響S型反硝化細菌豐度[38].

DGGE的條帶圖譜如圖3(b)所示,根據條帶位置和豐度計算香農指數的范圍分別是2.64~3.08和1.32~2.42.K型反硝化細菌相似度范圍是34.9%~ 69.2%;在相似度40%條件下聚類為3類,季節差異性高于采樣點間的差異性.而S型反硝化細菌所有站位的相似度范圍是8.1%~52.1%,在相似度10%條件下聚類成2類,樣品的季節和采樣點間差異均較大,反映出彌河的反硝化細菌中K型的多樣性明顯較高,且主要隨季節變化有所差異,而S型反硝化細菌樣品間差異更大,說明其群落組成波動較大.

圖3 反硝化細菌功能基因nirK和nirS豐度、聚類分析及系統進化樹

4,8,10表示采樣時間為4月、8月、10月,下同

選取M1-4、M3-8和M2-10樣品構建彌河K型反硝化細菌功能基因的克隆文庫(圖3c).以陽性克隆的菌株進行測序,并將測序結果的氨基酸序列與Pfam數據庫進行比對確認,共獲得101條K功能基因序列,不同序列間的相似性為32%以上.在80%相似度下,共獲得23個OTU,以的亞硝酸鹽還原酶A的氨基酸序列為外群,構建了K功能基因氨基酸序列的系統進化樹.彌河K型反硝化細菌的相近序列為-和變形菌門,相近序列多為不可培養的環境細菌,來源包括農田土壤、活性污泥、生物膜反應器、以及湖泊和近海的沉積物.S型反硝化細菌在彌河沉積物中的占比較低,以M3-8樣品構建了克隆文庫,共獲得49條功能基因序列,不同序列間的相似性達到45%以上.按照80%相似度共獲得15個OTU,以IM2的亞硝酸鹽還原酶氨基酸序列為外群,與相近序列編碼的氨基酸序列構建了系統進化樹.S型反硝化細菌的相近序列包含-、和-變形菌門,相近序列都來自于不同河流和河口的沉積物.

2.4 厭氧氨氧化細菌豐度與功能基因多樣性

聯氨合成酶Hzs是亞硝酸鹽還原成NO后與NH4+合成聯氨即肼(NH2NH2)的功能酶,其編碼基因A是厭氧氨氧化細菌的分子標志物,常用于研究厭氧氨氧化細菌的群落組成和環境豐度[27].彌河的A基因豐度如圖4(a)所示,范圍為2.58×102~ 1.14×104個/g,均值為2.04×103個/g,與東江河[39]、珠江入?？赱40]及法國Cape Fear河[41]的厭氧氨氧化細菌豐度相比偏低約一數量級.本研究中以聯氨氧化酶功能基因AB為標志物對厭氧氨氧化細菌進行了目標基因擴增,但未獲得目標條帶.

已知的厭氧氨氧化細菌均屬于浮霉菌目(Planctomycetes),由于其A序列差異較小,DGGE條帶分離不明顯,直接選取M3-8和M2-10的樣品構建了克隆文庫,驗證了彌河厭氧氨氧化細菌的存在及優勢種群.測序共獲得22條A序列,不同序列間的相似性為19%以上,3%相似度下共獲得10個OTU.通過與NCBI數據庫A基因氨基酸序列比對,發現均為“”屬,以另一主要屬的A氨基酸序列為外群,構建系統進化樹(圖4b).在珠江口入海斷面沉積物厭氧氨氧化細菌多樣性的研究也發現,鹽度較低的站位中,屬厭氧氨氧化菌是優勢種群[42].

圖4 厭氧氨氧化細菌功能基因hzsA豐度及系統進化樹

2.5 影響反硝化和厭氧氨氧化速率的主要因素

彌河的反硝化和厭氧氨氧化作用具有協同性,兩者顯著正相關,相關系數為0.72(=0.008).Zhou等[43]的研究發現,通過氯酸鹽抑制反硝化NO3-還原為NO2-的步驟,反硝化作用和厭氧氨氧化作用均會顯著降低,說明在NO2-含量較低的沉積環境中,厭氧氨氧化作用的進行依賴于反硝化作用第一步還原反應生成的NO2-,在長江口河域[44]以及沉水農田[37]中均觀測到厭氧氨氧化作用與反硝化作用的關聯性.目前在氮富營養化嚴重的河道,依賴反硝化的厭氧氨氧化作用作為生物修復手段被證實是同時去除NO3-和NH4+的有效途徑[45].

彌河的反硝化作用與沉積物間隙水中的PO43-呈顯著正相關(= 0.76,= 0.005),與沉積物的TN呈正相關(= 0.63,= 0.029);厭氧氨氧化作用與沉積物的TN呈顯著正相關(= 0.85,= 0.001),與沉積物密度呈負相關(= - 0.66,= 0.018).沉積物中的N素是氮去除過程的主要底物,是影響彌河反硝化和厭氧氨氧化速率的主要環境因子.受農業施肥非點源污染的影響,河流湖泊和近岸水體表現為磷限制的富營養化,氮磷比極高,磷成為重要的限制因子.在磷酸鹽限制條件下,反硝化作用將受到抑制,這一現象在磷限制水體的室內培養實驗中也得到證實,在PO43-濃度低于0.15mg/L時通過填加磷酸鹽可以顯著提高反硝化作用的速率,可能的原因是磷限制了反硝化細菌的生長尤其是反硝化聚磷菌這一類對磷酸鹽有較高依賴性的菌的生長[46].密度是沉積物重要的物理指標,但其對微生物及其地化循環的影響認知還較少,可能與厭氧氨氧化作用的底物NO2-來源于反硝化作用中間過程有關,沉積物的物理性質影響了NO2-在功能細菌間的輸運.

對上覆水、沉積物和間隙水的理化性質及功能細菌豐度對反硝化作用和厭氧氨氧化作用變化的影響分析發現沉積物的理化性質是影響反硝化作用和厭氧氨氧化作用的主要解釋因子,2分別為0.656和0.593,而功能細菌豐度的影響均較小.自然河流中,由于環境條件的波動性較大,細菌的生長和生理活動都會受到環境因子的限制,因此功能細菌和相應生態功能速率間的相關性并不顯著,在長江流域的河流中也發現沉積物的反硝化作用與細菌群落間不存在相關性[14].彌河的反硝化和厭氧氨氧化作用去除氮的效率主要取決于沉積物的理化性質,這一結果可以指導彌河富營養化的修復工作.

3 結論

3.1 彌河沉積物中存在反硝化作用和厭氧氨氧化作用,反硝化速率范圍為151.75~2847.86μmol/(m2×h),不同季節的均值為680.83μmol/(m2×h),厭氧氨氧化速率范圍為149.57~2109.17μmol/(m2×h),不同季節均值為898.32μmol/(m2×h),兩者在氮去除過程中的貢獻量相當.

3.2 彌河沉積物反硝化作用的功能細菌以K型為主,豐度0.19×106~5.12×106個/g,S型則較少,豐度范圍是7.19×103~2.23×105個/g,反硝化細菌主要為-和變形菌門;厭氧氨氧化細菌以A為基因標記的豐度為2.58×102~1.14×104個/g,主要是浮霉菌門的類群.

3.3 彌河的反硝化和厭氧氨氧化作用具有協同性,依賴于反硝化的厭氧氨氧化作用可能是彌河沉積物厭氧氨氧化作用的主要機制.沉積物的理化性質是解釋彌河反硝化和厭氧氨氧化速率差異的主要環境因子,其中TN作為反硝化作用和厭氧氨氧化作用的底物,與兩個過程呈正相關關系,此外PO43-濃度較低,作為環境限制因子與反硝化作用呈顯著正相關關系,而沉積物密度與厭氧氨氧化作用呈負相關關系.

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Denitrification and anammox processes in sediment of Mihe River, China.

LI Jia-lin1,2, QIN Song1,2*

(1.Laboratory of Coastal Biology and Bioresource Protection, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China；2.Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)., 2021,41(4)：1588~1596

Four sites were selected along Mihe River to sample the sediments and characterize physiochemical property to reveal denitrification/anammox processes and their constraints by isotope tracing experiment and molecular biological analysis. The results showed that the rates of denitrification varied from 151.75 to 2847.86μmol/(m2×h), and the anammox rates were in the range of 149.57 to 2109.17μmol/(m2×h). The relative contribution of anammox in the nitrogen removal was in an average of 56.1%. TheK type was the dominant denitrifier with the abundance of 0.19′106~5.12′106copies/g in the sediment, which was in the phylum of- and- Proteobacteria. The anammox bacteria marked byA gene was in the range of 2.58′102~1.14′104copies/g, which belonged to the Ca. Brocadia clades in Planctomycetes. Furthermore, the denitrification rate was positively related with TN content and PO43-concentration, while the anammox rate was positively related with TN content and negatively related with sediment density. The physiochemical property of sediment was the main condition determining the nitrogen removal rates. The results highlight that denitrification and anammox were of great significance to reduce nitrogen eutrophication, and sediment environment treatment was a considerable way to regular nitrogen removal rate.

denitrification；anammox；functional bacteria；impact factor；Mihe River

X524

A

1000-6923(2021)04-1588-09

李佳霖(1980-),女,山東煙臺人,副研究員,博士,主要從事環境微生物生態學研究.發表論文12篇.

2020-08-10

國家自然科學基金資助項目(41106100)

*責任作者, 研究員, sqin@yic.ac.cn