低度黑莓果酒發酵菌株篩選與工藝優化

韋夢婷 王英 劉小莉

摘要：檢測釀酒酵母FM-S-115、FY4和Lmb-1的耐糖、耐乙醇和耐SO2特性，再接種到黑莓汁中觀察實際發酵效果，綜合對比丹麥生物科技公司的商業發酵劑酵母RHYTHM.nsac，篩選出1株性能更優良的菌株FM-S-115。以加糖量、酵母添加量和發酵溫度3個因素優化發酵條件，考察主要營養成分和感官品質的變化，得出最適發酵工藝。結果表明，FM-S-115為最適發酵菌種，加糖量8%、接種量7.0%，20 ℃是最適發酵溫度，該條件下發酵的果酒口感協調、色澤鮮艷、乙醇度適宜。

關鍵詞：低度黑莓果酒;釀酒酵母;發酵工藝

黑莓為薔薇科懸鉤子屬灌木，果實飽滿，豐富多汁，色澤宜人，香味濃郁，富含多種色素、有機酸和維生素以及多種礦物質元素[1]。江蘇省中國科學院植物研究所于20世紀80年代從美國引入黑莓，通過數十年來的選育與試種，已基本掌握其生長、結果習性，目前在江蘇省南京市溧水區有較大的種植面積[2]。黑莓皮薄汁多，采摘之后不易保藏，加工成果酒是其產業發展的一個主要方向。

黑莓果酒是隨著黑莓的種植逐漸興起的新型食品，在原料的基礎之上，不僅富含多酚類物質，而且有著比其他果酒更有效的體外抗氧化的功效[3]。此外，黑莓中豐富的花青素也可預防心血管病，有效改善血管健康狀況，減少動脈粥樣硬化，預防冠心病和中風并降低患病風險[4]。低度果酒是乙醇含量比普通果酒低（體積分數為1.0%～8.0%），而營養成分基本不變的一類新型果酒[5]，不僅符合中國居民膳食指南推薦的健康飲食習慣，也可供更多種類人群食用，如青少年、老人等，是酒類研究的熱點方向。本試驗以釀酒酵母FM-S-115、FY4和Lmb-1為發酵菌種，首先檢測該3株菌株的耐糖、耐乙醇和耐SO2的特性，再發酵黑莓汁，測量發酵前后殘糖量、總酚含量、花色苷含量、單寧含量、乙醇度和顏色6個理化指標的變化，與科漢森（中國）有限公司的商業發酵劑釀酒酵母RHYTHM.nsac對比，以篩選出品質能與RHYTHM.nsac相當或者更優的菌株。使用該菌株發酵黑莓汁，以加糖量、酵母添加量和發酵溫度3個因素優化發酵工藝，測量果酒感官品質，選擇感官品質最好的為最適發酵工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料 黑莓凍果（-18 ℃貯藏）（南京雙吉農業發展有限公司）;釀酒酵母FM-S-115、FY4和Lmb-1，保存于江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室;商業發酵劑RHYTHM.nsac[科漢森（中國）有限公司]。

1.1.2 主要試劑 馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（PDB，北京奧博星生物技術有限責任公司）;白砂糖（食品級，蘇果超市有限公司）;果膠酶（食品級，寧夏夏盛實業集團有限公司）;偏重亞硫酸鉀（食品級，上海杰兔工貿有限公司）。

1.2 儀器與設備

UV-1600PC紫外分光光度計（上海美普達儀器有限公司）;SW-CJ-1C雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;LHS-80HC-Ⅰ生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）;YS6060臺式分光測色儀（深圳三恩時科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗時間和地點 本試驗于2019年5—7月在江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室完成。

1.3.2 黑莓果酒的制作工藝 冷凍黑莓果→解凍→打漿→調配（加白砂糖、果膠酶和焦亞硫酸鉀）→接種→發酵→原酒。

1.3.3 最佳釀酒酵母的篩選 通過測定酵母的耐糖、耐乙醇和耐SO2性能來篩選菌株。以PDB為基礎培養基，分別改變糖含量為2.0%、10.0%、140%、16.0%、18.0%和22.0%，改變乙醇含量為2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%和12.0%，改變SO2濃度為300、400、500、600、700 mg/L，每組試驗1個變量，其他條件保持一致，將預先活化好的菌液（菌體濃度為1.01×108～1.11×108 CFU/mL）以3%的接種量接入培養液中，28 ℃、150 r/min，培養16 h，3組平行試驗，測定菌體稀釋5倍下菌液的D600 nm。

檢測實際發酵中4株酵母性能。將4株菌以5%的接種量接種到黑莓汁中，觀察其發酵時間，發酵結束時的殘糖量、總酚含量、花色苷含量、單寧含量、色差和整體感官品質。將FM-S-115、FY4與Lmb-1和商業發酵劑RHYTHM.nsac 為參照，選出最合適的發酵菌種。

1.3.4 低度黑莓果酒發酵工藝的單因素試驗 以加糖量、酵母添加量和發酵溫度3個因素優化發酵工藝。加糖量直接決定果酒的乙醇度，純黑莓汁的糖含量為110 g/L，選擇加糖量為0.0、4.0%和80% 3個梯度;酵母添加量選擇3.0%、5.0%、70%、9.0% 4個梯度;發酵溫度選擇20、25、30 ℃ 3個梯度。每組試驗1個變量，其他條件須一致。每組試驗重復3次，殘糖量4 g/L以下即為發酵結束，測量各指標的變化。

1.3.5 低度黑莓果酒發酵工藝優化的正交試驗 單因素試驗確定加糖量、酵母添加量和培養溫度3個因素3個水平，借助正交設計助手Ⅱ軟件，確定最適合低度黑莓果酒釀造的條件。正交試驗的因素和水平設計見表1。

1.3.6 各指標的檢測方法 殘糖量測定使用苯酚硫酸法，具體步驟見參考文獻[6]。

總酚含量測定用Folin-酚試劑法，具體步驟見參考文獻[7]。

花色苷含量測定使用pH值示差法，具體步驟見參考文獻[8]。

單寧含量測定采用甲基纖維素沉淀法。（1）標準曲線的制作。以表兒茶素水溶液計，分別測濃度為0、10、25、50、75、100、150、200 mg/L的表兒茶素水溶液在280 nm下的吸光度，以表兒茶素水溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程y=0.009 81x+0.028 8，r2=0996 1。（2）樣品的單寧含量測定。2支試管，各取樣 200 μL，分別加入2 400 μL蒸餾水（對照組）和004%甲基纖維素（處理組），搖勻靜置3 min，各加1 600 μL飽和硫酸銨溶液，定容至8 mL。搖勻靜置10 min，離心10 min，轉速1 000 r/min，取上清液，測2支試管的D280 nm。

D280 nm（單寧）=D280 nm（對照組）-D280 nm（處理組）。（1）

乙醇度的測定采用蒸餾法，具體步驟見參考文獻[8]。

色差的檢測方法。采用CIELab顏色參數[9]測定果酒的顏色。參考該方法使用色差儀測出參數L*（亮度）、a*（紅綠）和b*（黃藍）?？偵睿é*）是用來描述2組顏色整體對比差異的參數。

感官評定。根據 GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官分析法[10]，分別從色澤、澄清度、香氣、滋味及典型性對黑莓果酒進行感官評定（表2）。

2 結果與分析

2.1 4株酵母的耐糖性能測定

果酒釀造，須適量添加果膠酶、葡萄糖和SO2，以助充分發酵和抑菌，釀酒酵母須對這3種物質具有一定的耐性。由圖1看出，在10.0%～14.0%的添加量內，所有菌株生長良好;大于14.0%時，生長量開始下降，與劉暢等試驗得出在糖含量10.0%之后就開始下降[11]相比，本試驗的4株菌株耐糖性更高。雖總體趨勢相似，菌株之間各有不同，FM-S-115和RHYTHM.nsac的生長量始終高于FY4和Lmb-1，且前者最適生長濃度更高。

2.2 4株酵母的耐乙醇性能測定

由圖2可知，乙醇對酵母有抑制作用。在濃度為0.0～6.0%內，所有菌株均能保持較高的生長密度;6.0%～8.0%時開始下降，FY4和Lmb-1菌體密度下降速度緩慢，FM-S-115和RHYTHM. nsac下降迅速;乙醇濃度大于8.0%時，所有菌株的生長被嚴重抑制;12.0%時，除了Lmb-1的D600 nm值還能保持在0.5左右，其他菌株均接近于0，基本停止生長，可見Lmb-1相比其他幾株菌更耐乙醇，在釀造高度酒上具有很大優勢。與李錚等的試驗結果得出的乙醇耐受性達到16.0%[12]相比，本試驗4株酵母耐受性較低，還有待馴化提高。然而在釀造低度果酒上，4株菌均能夠成為優勢菌，完成發酵進程。

2.3 4株酵母的耐SO2性能測定

由圖3可知，在300 mg/L以內，4株菌均有較高的耐受性;大于300 mg/L時，菌體密度下降明顯，但D600 nm值仍保持相對較高，在0.9左右。可見，相比于吳啟鳳等研究得出僅有1株菌能在300 mg/L濃度下存活的結果[13]來說，試驗中4株菌均有較高的耐SO2性。雖FY4和Lmb-1的耐性略低于其他2株菌，在釀酒所需濃度內，4株菌均能滿足發酵要求。

2.4 4株酵母的黑莓果酒發酵性能測定

在有氧的條件下，酵母通過呼吸作用將黑莓汁中的白砂糖轉化為乙醇和其他副產物，有些為有益副產物，賦予果酒獨特的芳香風味，少量為有害產物，抑制酵母生長，所以菌種不同，發酵產酒的風味和口感各異[14]。由表3可知，4株菌中FM-S-115和RHYTHM.nsac感官品質最好，作為1株較為成熟的發酵菌株，RHYTHM.nsac各活性物質均損失較少，FM-S-115與之相比，各指標大致相同，且FM-S-115發酵結束所需時間更短，發酵速度更快，這一點在實際生產中意義重大。

綜合耐糖、耐乙醇和耐SO2性能和菌株發酵黑莓果酒品質分析的結果，菌株FM-S-115 的耐糖、耐乙醇和耐SO2性最好，發酵過程對黑莓中的活性物質損失最小且乙醇度較高。和性能成熟的商業發酵劑RHYTHM. nsac相比，FM-S-115各方面性能與其接近，且發酵時間更短，因此選擇FM-S-115為低度黑莓果酒的最佳發酵菌種。

2.5 低度黑莓果酒發酵工藝優化的單因素試驗

2.5.1 加糖量對果酒發酵的影響 由表4可以看出，加糖量越高， 發酵時間越長，乙醇度和總色差的變化明顯，未加糖處理組的初始總糖含量為118613 g/L，發酵時間短，結束時乙醇含量低，黑莓的酸味略重，酒香上略有欠缺;4.0%加糖量處理組的初始總糖含量為 222.613 g/L，發酵結束活性物質花色苷、單寧損失較多，且感官品質略差;8.0%的加糖量處理組的初始糖含量為286.347 g/L，發酵結束時乙醇度達到7.5%，含量適中，但總色差變化較明顯，色澤損失較多。整體感觀上，8.0%的加糖量的感觀評分最高，果酒澄清透明，有光澤，香氣純正、優雅，酒體豐滿、醇厚協調，黑莓的酸味和酒體的香味融合較好，且乙醇度相對較低，符合市場需求，因此8.0%是最合適的加糖量。

2.5.2 酵母添加量對果酒發酵的影響 由表5可知，酵母添加量對各個指標均有不同程度的影響。酵母添加量為3.0%和5.0%時，發酵時間略長;接種量為7.0%時，發酵時間最短，總酚、花色苷和單寧保留量最多，且感官評分最高;隨著接種量的繼續增大，感官評分開始下降，可能原因是接種量過大導致營養物質一部分被用于酵母的增殖，而用于無氧呼吸發酵的減少，乙醇含量降低[15]，且營養物質大量消耗和有害代謝產物積累，使發酵環境變差，從而導致菌體過早衰老自溶[16]。因此，試驗中選擇7.0%為最適酵母添加量。

2.5.3 溫度對果酒發酵的影響 由表6可以看出，隨著發酵溫度的升高，酵母活性提高，發酵時間縮短，感官評分逐漸降低，在20 ℃時口感最好。溫度過低，發酵時間長，易發酵不徹底;溫度過高會使酵母活動加劇，導致酵母過早老化死亡，同時伴隨一些高級醇等副產物的產生，影響果酒的風味和品質[17]，因此選擇20 ℃為最適發酵溫度。

2.6 低度黑莓果酒發酵工藝優化的正交試驗

本研究選擇加糖量、酵母添加量、發酵溫度3個變量因素作為低度黑莓果酒品質的影響因素。以感官評分為考察指標，按照表1進行試驗，試驗結果見表7。由表7可知，3個因素對黑莓果酒的感官評分的影響大小依次為發酵溫度、加糖量和酵母添加量，最佳組合為A2B2C2，即發酵溫度為20 ℃，加糖量8%，接種量為7%。由表8可知，發酵溫度、加糖量、酵母添加量對黑莓果酒感官評分影響都顯著（P<0.05）。