僵蠶堿溶性蛋白質的提取工藝優化及指紋圖譜分析

朱銳靈 黃佳瀅 劉瑩

摘要：建立稀堿法提取僵蠶蛋白質的最佳工藝，并對其進行相應SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）指紋圖譜分析。單因素考察緩沖液pH值、液料比、提取時間和提取溫度對僵蠶堿溶性蛋白質提取率的影響，隨后以Box-Behnken組合設計響應面優化，對試驗結果進行回歸擬合分析，獲得上述因素對堿溶性蛋白質提取率的量化關系，確定最佳提取條件，并對提取的堿溶性蛋白質進行SDS-PAGE指紋圖譜分析。結果表明最佳提取工藝條件為：Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）緩沖液pH值8.0、液料比58 mL ∶ 1 g，提取溫度為40 ℃，提取時間為 205 min，此時堿溶性蛋白質提取率可達2.29%。SDS-PAGE指紋圖譜結果表明僵蠶堿溶性蛋白質含有29.85、27.28 ku 2條遷移率相近的高豐度特征性條帶，分別占總蛋白量的36.37%、32.65%，同時還有78.8、69 ku較高豐度特征性條帶，該指紋圖譜具有種屬特異性。本研究建立了僵蠶堿溶性蛋白質的最佳提取工藝條件，所得SDS-PAGE指紋圖譜可為僵蠶藥材的分子鑒定提供參考依據。

關鍵詞：僵蠶;堿溶性蛋白質;響應面;提取工藝;指紋圖譜

僵蠶（Bombyx Batryticatus）為蠶蛾科昆蟲家蠶（Bombyx mori L.）4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌[Beauveria bassiana （Bals.） Vuillant]而致死的干燥體，為我國常用的大宗動物類中藥材[1]。因其息風止痙、祛風止痛、化痰散結的功效，僵蠶常用于抽動障礙、支氣管哮喘、頑固性蛋白尿及多種兒科疾病的臨床治療，且療效甚佳[2-3]。由于僵蠶售價較高，市場常見增質量僵蠶、綠僵蠶、黃僵蠶、鼓炒僵蠶等偽品出售，嚴重影響臨床用藥的安全性與有效性[4]。

當前僵蠶主要由藥工依其身直、肥壯、質堅、色白、斷面光亮程度鑒別真偽及劃分等級。此外，趙建國等用紅外光譜法鑒別僵蠶[5]，張麗增等用薄層法鑒別僵蠶及含有僵蠶的中成藥[6]，賈靜等建立了僵蠶藥材的DNA條形碼，為建立相應分子鑒定技術提供了參考[7]。僵蠶含有豐富的蛋白質，但未有系統提取工藝及特征種屬蛋白質研究的報道。本研究旨在建立僵蠶蛋白質的稀堿法提取工藝，并以Design-Expert軟件進行響應面優化，進而建立僵蠶堿溶性蛋白質的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）指紋圖譜，為后續研究基于蛋白質組成的僵蠶分子鑒定技術提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

僵蠶于2019年購自安徽亳州中藥材市場（批號9-23539），經江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌而致死的干燥體。

牛血清白蛋白（BSA）、Bradford蛋白濃度測定試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司];蛋白質分子量標準品（上海碧云天生物技術有限公司）;丙烯酰胺、N，N′-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍R-250（中國醫藥集團有限公司）。

1.2 儀器與設備

CS-700高速智能粉碎機（武義海納電器有限公司）、SpectraMax 190酶標儀（美國Molecular devices公司）、H1650-W臺式微量高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、FE20型實驗室pH計（Mettler Toledo 公司）、垂直電泳槽VE-180（上海天能科技有限公司）、DYY-6C穩流穩壓電泳儀（南京馳順科技發展有限公司）、GenoSens 2100凝膠成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質提取 僵蠶藥材水洗后40 ℃烘干，打粉后過70目篩，稱取適量僵蠶粉末，按預設液料比加入0.1 mol/L Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）緩沖液，50 ℃水浴振蕩，到預設提取時間后以9 700 g離心10 min，上清即為堿溶性蛋白質樣品。

1.3.2 蛋白質提取率測定 以考馬斯亮藍（Bradford）法測定蛋白質含量，牛血清白蛋白溶液作為蛋白質工作液，測定溶液的D595 nm[8-9]。以蛋白質濃度為橫坐標x，吸光度為縱坐標y，繪制標準曲線，得到回歸方程y=2.925 7x+0.191 3（r2=0999 3）。對“1.3.1”節所述蛋白質樣品進行相應的處理，測定D595 nm值，依據標準曲線可得蛋白質含量，按式（1）計算蛋白質提取率。

蛋白質提取率=提取液中的蛋白質質量僵蠶粉末質量×100%。（1）

1.3.3 單因素試驗 （1）pH值對僵蠶蛋白質提取率的影響試驗。固定提取溫度50 ℃，提取時間 200 min，液料比40 mL ∶ 1 g，Tris-HCl緩沖液pH值分別設置為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。（2）液料比對僵蠶蛋白質提取率的影響試驗。固定Tris-HCl緩沖液pH值8.0，提取溫度50 ℃，提取時間 200 min，液料比分別設置為10 mL ∶ 1 g、25 mL ∶ 1 g、40 mL ∶ 1 g、55 mL ∶ 1 g、70 mL ∶ 1 g。溫度對僵蠶蛋白質提取率的影響試驗：固定提取時間200 min，Tris-HCl緩沖液pH 值為8.0，液料比為55 mL ∶ 1 g，提取溫度分別設置為30、40、50、60、70 ℃。（3）時間對僵蠶蛋白質提取率的影響試驗。固定提取溫度40 ℃，Tris-HCl緩沖液pH值為 80，液料比為 55 mL ∶ 1 g，提取時間分別為100、150、200、250、300 min。

1.3.4 響應面試驗 采用Design-Expert（8.0.6.1）軟件，根據Box-Behnexn設計響應面試驗，以Tris-HCl緩沖液pH、液料比、提取溫度、提取時間4個因素為自變量，僵蠶堿溶性蛋白質提取率為響應值，設計4因素3水平響應面分析試驗，其因素與編碼水平見表1。

1.3.5 SDS-PAGE分析 利用最佳條件下提取得到的僵蠶提取液，向其中加入體積分數為10%的三氯乙酸（TCA），渦旋，14 000 r/min離心10 min，棄溶液。加入適量丙酮后，再次渦旋，離心，得到僵蠶堿溶蛋白質。加裂解液，置于4 ℃冰箱中待其充分溶解，加上樣緩沖液，沸水浴煮沸10 min，即得到蛋白質電泳樣品。制備5%濃縮膠和14%分離膠，80 V 恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑距離凝膠底部05 cm處，停止電泳，剝凝膠，進行固定、染色、脫色[10]。

1.3.6 凝膠分析 使用凝膠成像儀對凝膠拍照，用Quantity One軟件計算僵蠶堿溶性蛋白質的分子量和灰度值，按式（2）計算各蛋白質的含量。

蛋白質含量=待測蛋白質灰度值蛋白質總灰度值×100%。（2）

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

蛋白質為兼性分子，緩沖液pH值可以顯著影響其溶解度?？疾靝H值為 7.0～9.0時僵蠶堿溶性蛋白質的提取率變化，結果見圖2-A。在pH值為7.0～8.0之間，堿溶性蛋白質的提取率隨著pH值的升高而增加，當pH值達到8.0時提取率為最高，隨后提取率隨pH值升高而逐步降低。因此，緩沖液pH值為 8.0為最適條件。

緩沖液體積越大，越有利于蛋白質的溶出，但過高的液料比會導致后處理較為困難。考察液料比為（10～70） mL ∶ 1 g時僵蠶堿溶性蛋白質提取率變化，結果見圖2-B。在一定范圍內，隨著提取液體積的增大，僵蠶堿溶性蛋白質的提取率呈上升趨勢，液料比為55 mL ∶ 1 g時提取率達到最大值。進一步提高液料比，蛋白質提取率反而呈下降趨勢，因此，液料比55 mL ∶ 1 g為最適條件。

提取溫度升高可以加速蛋白質溶出，且增加其溶出量?？疾焯崛囟葹?0～70 ℃時僵蠶堿溶性蛋白質提取率變化，結果如圖2-C所示。在30～40 ℃的范圍內，蛋白質提取率逐漸增加，40 ℃時達到最大值。進一步升高提取溫度則導致蛋白質提取率逐步降低，可能由溫度升高導致僵蠶蛋白質變性所致，因而最適提取溫度為40 ℃。

提取時間延長可以增加蛋白質溶出量?？疾焯崛r間為100～300 min時僵蠶堿溶性蛋白質提取率變化，結果見圖2-D。提取時間在100～200 min 內時，提取率呈直線式上升趨勢;提取時間超過200 min后，提取率卻隨著提取時間的延長而緩慢下降。因此最佳提取時間為200 min。

2.2 響應面分析及優化條件

根據單因素試驗結果，設計響應面優化試驗（表1），綜合考察緩沖液pH值、液料比、提取溫度和提取時間對蛋白質提取率的影響，試驗結果見表2，僵蠶蛋白質提取率在1.495%～2.275%。

對二次回歸方程進行方差分析，結果見表3。從表3可知，回歸模型具有極顯著性（P<0.01），失擬項不顯著（P>0.05），可知該回歸模型可以較好地擬合實測值。在此次試驗中，一次項B影響顯著，二次項A2、B2和C2對蛋白質提取率影響極顯著，交互作用項除CD外P值均大于0.05，表明交互作用不顯著。4個單因素對蛋白質提取率的影響順序為液料比>提取液pH值>提取時間>提取溫度。

2.3 響應曲面的分析

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對回歸方程進行分析，得到等高線和響應曲面，見圖3，考察4個因素及兩兩因素的交互作用對僵蠶蛋白質提取率的影響。

由圖3-A可知，液料比的曲面較陡，說明對僵蠶蛋白質的提取率影響顯著;pH值的曲面比較平緩，且隨著pH值的增加，蛋白質提取率先增加后降低。等高線形狀呈橢圓形，表明pH值和液料比的交互作用顯著。由圖3-B可知，隨著pH值的增加與溫度的升高，蛋白質提取率先上升后下降，從2個因素的曲面來看，說明pH值對蛋白質提取率的影響比溫度更大。等高線呈圓形，證明pH值和溫度的交互作用不顯著。由圖3-C可知，隨著提取的時間延長，提取率先增加后略微降低;等高線圖表明2個因素的交互作用顯著。由圖3-D可知，響應面反映出蛋白質提取率隨著液料比的增加先上升后下降;從等高線可知，沿液料比軸向等高線比沿溫度軸向等高線密集，表明液料比對蛋白質提取率影響更明顯。由圖3-E可知，時間對蛋白質提取率的影響沒有液料比顯著，等高線圖的形狀為圓形，說明兩因素的交互作用不顯著。由圖3-F可知，隨著時間延長和溫度提高，蛋白質提取率均呈現先增加后減少的趨勢。等高線圖可表明時間和溫度的交互作用顯著。

2.4 驗證試驗

通過響應面回歸模型，確定提取僵蠶蛋白質的最佳條件：pH 值為8.12，液料比為58.03 mL ∶ 1.00 g，溫度40.06 ℃，時間204.49 min。在此條件下，預測其提取率值2.33%。考慮實際操作，設置條件為：pH 值8.0，液料比58 mL ∶ 1 g，溫度40 ℃，時間 205 min，此時平均提取率為2.29%，與理論值基本吻合。

2.5 SDS-PAGE指紋圖譜分析

SDS-PAGE在蛋白質的量化、比較及特性鑒定中是一種經濟、方便和重復性好的方法[11-13]。僵蠶堿溶性蛋白質的SDS-PAGE指紋圖譜結果（圖4）表明，僵蠶蛋白質含有29.85 ku（c）與27.28 ku（d）的 2 條遷移率相近的高豐度特征性條帶，分別占總

蛋白量的36.37%與32.65%，同時還有78.8 ku（a）和69 ku（b）的較高豐度特征性條帶。范瑋等進行的僵蠶、蜈蚣、土鱉蟲的蛋白質指紋圖譜對比研究，也表明了上述條帶的種屬特異性[14]。由圖4可知，26～120 ku區間至少可觀察到11條蛋白質條帶，25 ku 以下區間還至少可觀察到12條蛋白質條帶，分辨率優于已有文獻報道的結果。

3 結論與討論

近年來，已有很多響應面法優化蛋白質提取工藝的報道。田景民等利用響應面法優化沙棘籽渣水溶性蛋白質的提取工藝[15];王岸娜等采用響應面

法優化超聲輔助提取獼猴桃糖蛋白，與傳統提取法相比較，明顯縮短時間且蛋白得率提高[16];劉合生等采取響應面法優化水飛薊子中的可溶性蛋白質提取工藝[17];張紅霞等采用響應面法優化苦蕎蛋白質的提取工藝，使其提取率達到1.27%[18]。本研究首次嘗試稀堿法提取僵蠶蛋白質，在單因素試驗基礎上對提取工藝進行響應面優化，確定了僵蠶堿溶性蛋白質的最佳提取條件：緩沖液pH 值為8.0，液料比為58 mL ∶ 1 g，提取溫度為40 ℃，提取時間為205 min。此時僵蠶蛋白質提取率為229%。驗證試驗表明實際值與理論值相吻合，證明響應面法可以有效優化僵蠶蛋白質提取條件，為充分利用僵蠶蛋白質資源提供科學依據。本研究同時建立的僵蠶堿溶性蛋白質SDS-PAGE指紋圖譜，為開發基于蛋白質的僵蠶分子鑒定方法提供了參考依據，也為其他動物類中藥材的鑒定提供思路。

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