稻草秸稈發酵液的抑藻效應及其機理

胡春霞,陳 波,張庭廷,*

稻草秸稈發酵液的抑藻效應及其機理

胡春霞1,陳 波2,張庭廷1,2*

(1.紹興文理學院元培學院,浙江 紹興 312000；2.安徽師范大學生命科學學院,安徽 蕪湖 241000)

為有效利用農業廢棄物稻草秸稈進行抑藻,本研究對不同稻草秸稈進行了特定方式的發酵,測定了發酵液對常見淡水藻類的化感效應,探討了其中抑藻作用強的發酵液抑藻機理.結果表明:與普通稻草秸稈發酵液相比,水稻分蘗枝發酵液對銅綠微囊藻的抑制效果顯著好于普通稻草秸稈發酵液(<0.05),作用72h水稻分蘗枝發酵液抑制率為93.21%,168h為97.96%,而稻草秸稈發酵液120h抑制率為68.20%,168h抑制率反而顯著下降,只有27.65%;前者Eh50為14.073h,后者為21.036h;水稻分蘗枝發酵液對藍藻(銅綠微囊藻)和綠藻(蛋白核小球藻、斜生柵藻)3種淡水藻均有良好抑制作用,對銅綠微囊藻抑制作用最佳(<0.05).在水稻分蘗枝發酵液脅迫下,銅綠微囊藻葉綠素a以及藻藍蛋白(PC)和別藻藍蛋白(APC)含量下降,藻細胞葉綠素自發熒光值持續降低,藻細胞結構破壞.推測水稻分蘗枝發酵液的抑藻機制之一是將藻細胞光合系統作為其攻擊的靶點從而抑制藻類生長,并最終破壞細胞結構,引起細胞凋亡.

水稻分蘗枝；化感作用；抑藻機理；光合作用

在水華治理的研究中,農作物廢棄秸稈的化感抑藻作用由于其價格低廉、生態安全性好受到了高度關注.其中,有關水稻秸稈的抑藻效應有較多報道.有研究指出稻草浸泡液對銅綠微囊藻有良好抑制作用[1-3];而多數研究表明單純稻草浸泡液抑藻效果并不顯著[4-6],只有經過發酵的稻草才有抑藻作用,認為抑藻物質是在稻草發酵過程中形成的[7-8].對于稻草抑藻機制報道較多的是其對藻細胞光合作用的影響,葉綠素a的破壞、氧化作用、細胞損傷等[1,3,5].本課題組在前期研究中發現未經發酵的稻草抑藻效果不顯著,而且稻草種類多,不同種類稻草的抑藻作用各異[1-4].為了充分挖掘和發揮稻草秸稈的抑藻效能,尋找到成本低、抑藻效果顯著、生態安全性好的抑藻材料,本研究比較了經過特定發酵后的兩種不同稻草秸稈發酵液的抑藻作用,探討其中抑藻效能好的發酵液的抑藻機理,旨在為水華藻類控制以及廢棄稻草秸稈的再利用提供理論依據和技術支持.

1 材料與方法

1.1 材料

水稻秸稈()、水稻分蘗枝()采自蕪湖火龍崗鎮周邊農田;水稻分蘗枝為水稻收獲后根部重新生長分蘗出的青綠色分蘗枝.

銅綠微囊藻()、斜生柵藻()、蛋白核小球藻()均購自中國科學院武漢水生生物研究所藻種庫. 銅綠微囊藻采用BG-11培養基培養,斜生柵藻和蛋白核小球藻采用HB4培養基培養;纖維素酶(食品級)購自南寧龐博生物工程有限公司;乳酸菌(食品級)主要成分保加利亞乳桿菌()、嗜熱鏈球菌()、嗜酸乳桿菌()等購自佰生優生物科技有限公司;石油醚(AR)、氯仿(AR)、乙酸乙酯(AR)、旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠 RE 52-86A)、流式細胞儀FACSCantoⅡ(美國 BD)、氣相色譜儀(安捷倫 GC 6890,FID)、質譜儀(安捷倫 5975inert- GC/MSD).

1.2 實驗方法

1.2.1 藻種培養 實驗前,對3種實驗藻種進行擴大培養,使藻細胞進入對數生長期.向已滅菌的1000mL錐形瓶中加入100mL培養基,接入100mL藻液,充分搖勻后放入光照培養箱培養;培養條件設置為:光照強度4000Lx,光暗比12h:12h,溫度(25±1)℃;之后每天加入100mL培養基,培養時間為7d,每天搖動錐形瓶3~4次[9-10].

1.2.2 稻草秸稈發酵液抑藻實驗 將收集到的稻草秸稈(水稻秸稈、水稻分蘗枝)在自然條件下風干,剪成2cm小段,粉碎過40目篩網備用.稱取兩種秸稈粉末各30g分別放入500mL錐形瓶中封口,121℃高壓蒸汽滅菌20min;冷卻后,按照料水比(1:10質量比)加入超純水;再按照秸稈粉末總量的1%添加纖維素酶和0.5%乳酸菌[11-12];封口,充分混合后置于35℃下厭氧發酵30d.最終分別得到水稻秸稈、水稻分蘗枝兩種不同發酵液.發酵液均先用定性濾紙抽濾,再用0.22μm微孔濾膜過濾除去微生物,定容到100mL,4℃保存備用.

取250mL滅菌錐形瓶9個,每個錐形瓶加入100mL對數期銅綠微囊藻,藻液初始密度為6.0× 106cells/mL,然后加入水稻秸稈或水稻分蘗枝發酵液,添加量為1.25%(/),同時設置空白對照組,每組3個重復,置于光照培養箱培養,培養條件同藻種培養.每24h取藻液用血球計數板進行藻細胞計數,計至168h.

1.2.3 水稻分蘗枝發酵液對3種淡水藻類的抑制作用 分別取對數期銅綠微囊藻、蛋白核小球藻和斜生柵藻(初始藻密度分別為3.5×106, 1.4×106和1.9×106cells/mL)3種藻液各100mL加入到滅菌的250mL錐形瓶中,再加入水稻分蘗枝發酵液,各設置0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、和1.25%(/)5個濃度梯度,同時設置空白對照組,每組3個重復,于1.2.2培養條件進行培養并計數.

1.2.4 水稻分蘗枝發酵液對銅綠微囊藻光合系統的影響 將對數期銅綠微囊藻用BG-11培養基稀釋到1.3×106cells/mL;向已滅菌的500mL錐形瓶中接入300mL藻液,設置0.25%、0.35%、0.45%、0.55%和0.65%(/)5個濃度組以及空白對照組,每個濃度設置3個重復,置于光照培養箱中,培養條件同1.2.2,于實驗第1,3,5d分別取樣測定有關參數.

銅綠微囊藻葉綠素a含量測定參照文獻[10];銅綠微囊藻自發葉綠素熒光的測定參照文獻[13]方法,取藻液1mL,經300目絹篩過濾后移入樣品管中,用流式細胞術(FCM)的PE-Cy5通道采集10000個藻細胞自發葉綠素熒光信號,激發波長488nm,進樣流速12μL/min,每次采集數據前進樣時間超過10s.用Flowjo軟件計算所檢測到的信號值,記為平均熒光強度,按以下公式計算葉綠素相對熒光強度:相對強度=實驗組熒光強度/對照組熒光強度×100%

藻膽蛋白含量測定參照文獻[14]方法,取藻液5mL,離心(10000r/min,10min),棄上清,加入5mL PBS (0.05mol/L,pH值6.8),置于-80℃冷凍8h,于室溫下避光自然溶解,反復3~4次;再離心(10000r/min, 10min),取上清,測定620, 650, 565nm處吸光值,按公式(1)分別計算藻藍蛋白(PC)和別藻藍蛋白(APC)含量:

PC(mg/L)=(OD620-0.70OD650)/7.38(1)

APC(mg/L)=(OD650-0.19OD620)/5.65

藻細胞膜完整性測定方法參照文獻[15],取藻液1mL,經300目絹篩過濾后移入樣品管中,加入碘化丙啶(PI)使終濃度為0.0668g/L,25℃染色15min.用FCM的PE-Texax Red通道檢測10000個藻細胞熒光信號,激發波長為488nm,進樣流速12μL/min,每次采集數據前進樣時間超過10s.用Flowjo軟件計算所檢測到的信號值,記為平均熒光強度,劃分為正常群和激發群,分別統計占樣品細胞的百分比.

1.3 數據處理

通過公式(2)計算抑制率:

式中:IR表示抑制率, %;表示不同處理組的藻密度, cells/mL;0表示同期對照組的藻密度, cells/mL.采用Excel 2003進行數據處理,通過SPSS 21.0軟件對各組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA),并用最小顯著性差異 (LSD)方法進行多重比較檢驗,<0.05表示有顯著性差異,<0.01 表示有極顯著性差異. 使用Probit計算時間序列上的Eh50(表示達到50%抑制效應所需要的時間)以及對3種藻的半效應濃度(EC50).

2 結果與分析

2.1 稻草秸稈發酵液的抑藻效應

2.1.1 兩種水稻秸稈發酵液對銅綠微囊藻生長的影響 圖1表示的是稻草秸稈發酵液及水稻分蘗枝發酵液對銅綠微囊藻生長的影響.兩種發酵液在相同濃度時對銅綠微囊藻均有良好的抑制作用,與同期對照組相比均具有極顯著差異(<0.01),但水稻分蘗枝發酵液具有更好的抑藻效應.由表1可知,72h時水稻分蘗枝發酵液抑制率就達到了93.21%,至168h其抑制率達到97.96%,而稻草秸稈發酵液在120h時抑制率才達到68.20%,在168h時抑制率反而顯著下降,只有27.65%.兩種發酵液的Eh50分別為21.036h (稻草秸稈發酵液)和14.073h(水稻分蘗枝發酵液),水稻分蘗枝發酵液不僅在很短時間內達到了半抑制效應,而且持續處于很高的抑制狀態沒有出現反彈.由此可見不同稻草發酵液可能因其含有的抑藻成分不同因而有不同的抑藻效能.

圖1 兩種不同水稻秸稈發酵液對銅綠微囊藻細胞密度的影響

表1 兩種稻草秸稈發酵液對銅綠微囊藻的抑制率(%)

注:表中數據為平均值±SD(=3); 同一列,相同小寫字母表示在0.05水平上無顯著性差異;不同小寫字母表示在0.05水平上有顯著性差異;同一行,相同大寫字母表示在0.05水平上無顯著性差異;不同大寫字母表示在0.05水平上有顯著性差異,下同.

2.1.2 水稻分蘗枝發酵液對3種淡水藻類生長的影響 表2是不同濃度水稻分蘗枝發酵液對3種藻類的抑制率.總體看,不同濃度水稻分蘗枝發酵液對3種藻類均有一定抑制作用,且均具有濃度和時間相關性,即濃度越大抑制作用越明顯,在實驗期內,作用時間越長效果越好;除最低濃度組(0.25%),在實驗期間表現為增長效應,抑制率為負值,其余濃度組發酵液對藍藻的生長抑制作用遠遠好于對兩種綠藻,具有統計學上的顯著差異,<0.05或<0.01.作用96h時,最大濃度處理組對銅綠微囊藻、蛋白核小球藻及斜生柵藻的抑制率分別為95.66%、83.68% 和50.90%.但對于蛋白核小球藻,只有在發酵液濃度為1.00%和1.25%時才表現為抑制效應,而在3個低濃度組幾乎均是增長效應,抑制率大多為負值;對斜生柵藻,在實驗第24h時各濃度組均出現了抑制作用,但第48h時, 0.50%~1.25%組均出現了反彈,表現為增長效應,隨著時間推移,各濃度組均為抑制作用.表3顯示了該發酵液依次對這3種藻類作用72h的EC50值分別為0.257%、0.851%、0.910%,由此可看出水稻分蘗枝發酵液對蛋白核小球藻和斜生柵藻的EC50值分別是對銅綠微囊藻的3.3倍和3.5倍,說明該發酵液化感作用具有種屬選擇性,不同藻類對相同化感物質敏感性不同.

表2 不同濃度水稻分蘗枝發酵液對3種藻類的抑制率(%)

注:表中數據為平均值±SD(=3).

表3 水稻分蘗枝發酵液作用于3種藻的EC50及95%置信限(72h)

2.2 水稻分蘗枝發酵液對銅綠微囊藻抑制機理

2.2.1 對葉綠素a含量的影響 由圖2可見,中高濃度實驗組(0.55%,0.65%)第1d相較于對照組葉綠素a含量就具有顯著性差異(<0.01);至第5d各實驗組葉綠素a含量持續降低,與同期對照組相比均具有極顯著性差異(<0.01),最小濃度處理組(0.25%)和最大濃度處理組(0.65%)葉綠素a含量僅占同期對照組的30.7% 和14.6%,說明發酵液對銅綠微囊藻葉綠素合成具有很強的抑制作用.

2.2.2 對自發葉綠素熒光的影響 由圖3可看出水稻分蘗枝發酵液在時間和濃度兩個序列上對銅綠微囊藻自發葉綠素熒光均有不同程度的影響.就時間序列影響而言,最小濃度處理組(0.25%)第1d占同期對照組的69%、第3d占44%,第5d僅占對照組的25%,其余各濃度處理組也均表現出相似的作用效果, 表明水稻分蘗枝發酵液作用于銅綠微囊藻時間越長抑制作用越顯著;就濃度序列而言,濃度越高抑制效果越明顯.綜合濃度-時間看,隨著發酵液添加量和作用時間延長對銅綠微囊藻自發葉綠素熒光影響越顯著.

圖2 不同濃度水稻分蘗枝發酵液對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

**與同期對照組比較,<0.01

2.2.3 對藻膽蛋白含量的影響 由圖4可看出實驗第3d,相較于同期對照組,實驗組PC含量均顯著下降,<0.01,說明光合系統破壞嚴重,藻細胞利用光的能力下降;實驗第5d,0.25%和0.35%的低濃度處理組PC含量僅占同期對照組的26.8%和22.0%,而3個高濃度組PC 含量更低,依次分別為對照組的11.9%、13.8%和15.6%.

圖3 水稻分蘗枝發酵液對銅綠微囊藻自發葉綠素熒光的影響

不同小寫字母表示同一濃度不同時間的差異顯著,不同大寫字母表示不同濃度同一時間差異顯著

*與同期對照組比較,<0.05; **與同期對照組比較,<0.01

發酵液對APC 含量的影響也出現類似的變化.實驗第1d各實驗組APC含量就出現明顯下降,均具有顯著性差異(<0.05或<0.01).隨著作用時間延長各實驗組APC含量降低愈明顯,第5d最大濃度組APC含量僅占對照組的33.8%.

2.2.4 對藻細胞完整性的影響

PI為大分子染料,只有當細胞膜受損后才能進入胞內與核酸物質相結合激發產生橙紅色熒光,此時熒光強度增強,熒光強度同細胞膜受損程度呈正比.從圖5可看出在實驗第1, 3, 5d對照組激發群細胞占比始終維持在3%左右,這可能是藻生長過程中部分衰老細胞膜受損后PI結合核酸造成的熒光強度增強.而實驗組第1d隨著發酵液濃度增加激發群占比逐漸增多,最大濃度組(0.65%)占比達到了55%,至第5d占比達到75%;除最低濃度組外,各濃度組占比與同期對照組相比均具有極顯著差異(<0.01).

3 討論

近十多年來利用植物化感物質抑藻一直是研究的熱點[16-17].其中,利用植物大麥秸稈抑藻則是迄今植物化感抑藻應用最為成功的案例[18].利用稻草抑藻的研究也較多,但所得結論卻相差甚遠[19-21],這可能跟實驗時采用的條件以及所取的藻密度大小不同有關,與稻草種類或處理方式不同可能更有關.本研究采用普通稻草秸稈以及水稻分蘗枝,其發酵方式是在實驗室反復摸索得到,即添加一定量纖維素酶以及乳酸菌并且發酵30d,兩種發酵液對銅綠微囊藻均具有較佳抑制作用,但該研究首次發現水稻分蘗枝發酵液抑制作用顯著好于普通稻草發酵液.同時,水稻分蘗枝發酵液對銅綠微囊藻的抑制作用也明顯優于已發表的普通稻草抑藻文獻結果[1,21].由于水稻收割后,稻茬很快即可長出大量分蘗枝,利用該分蘗枝發酵液進行抑藻既可收到非常好的抑藻效果,又可為稻田廢棄秸稈的利用找到一種新的有效方式,環保且高效.

化感物質抑藻機制的報道很多[16-20],其中光合作用是藻細胞進行生命活動非常重要的環節.一些化感物質將光合作用系統作為攻擊藻細胞的靶點,破壞葉綠素a以及藻膽蛋白,降低藻細胞利用光能同化產物的積累來達到抑制甚至殺死藻細胞的作用,本實驗結果與前人研究的結論相似[22-23];同時PC和APC含量在水稻分蘗枝發酵液作用下也表現出相似的降低趨勢,藻膽蛋白含量的下降可能是由于發酵液中化感物質破壞了葉綠素使得藻細胞利用光能能力下降以致其轉化合成藻膽蛋白能力減弱造成的[23-24],而藻細胞葉綠素自發熒光值的持續走低也很好地佐證了這一結論的合理性.

完整且功能正常的細胞膜結構對細胞完成正常的生命活動至關重要.研究發現水稻分蘗枝發酵液會明顯破壞藻細胞結構,當藻細胞受到超過其可調控的化感物質脅迫后會經歷藻細胞聚集、細胞膜腫脹-萎縮直至最后潰縮死亡的過程,本實驗通過PI染色分析藻細胞在水稻分蘗枝發酵液作用下的細胞膜完整性證實了這一現象,這與前人研究結果相吻合[24-25].

4 結論

4.1 稻草秸稈和水稻分蘗枝發酵液對銅綠微囊藻均有一定抑制作用,但水稻分蘗枝發酵液抑制作用顯著強于稻草秸稈發酵液,其不僅在很短時間內達到了半抑制效應,而且持續處于很高的抑制狀態不出現反彈,可作為稻草秸稈抑藻材料的首選.

4.2 水稻分蘗枝發酵液對藍藻和綠藻的抑制作用具有一定種群選擇性,抑制效果依次為:對銅綠微囊藻的抑藻效果>蛋白核小球藻>斜生柵藻,即對藍藻的抑制作用顯著好于對綠藻.

4.3 水稻分蘗枝發酵液對銅綠微囊藻的抑制機制之一可能是將藻細胞光合系統作為其攻擊的靶點從而抑制藻類生長,并最終破壞細胞結構,引起細胞凋亡.

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Study on the algae inhibition effect and mechanism of the fermented liquid of rice straw.

HU Chun-xia1, CHEN Bo2, ZHANG Ting-ting1,2*

(1.Yuanpei College of Shaoxing University, Shaoxing 312000, China；2.College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)., 2021,41(4)：1925~1931

In order to use agricultural waste rice straws to inhibit algae growth more efficiently, this study experimented specific fermentation of different rice straws, measured the allelopathy performance of the fermentation liquids on common freshwater algae, and discussed the mechanism of fermentation liquid with strong algae inhibition. The results showed that compared with ordinary rice straw fermentation liquids, the fermentation liquid with rice tillering branch had significantly better inhibitory effect on(<0.05), and the inhibition rate after 72h treatment was 93.21%, then increased to 97.96% at 168h. With the treatment of the ordinary rice straw fermentation liquid, the corresponding inhibition rate at 120h was only 68.20%, then decreased significantly to only 27.65% at 168h. The Eh50was 14.073h for the former and 21.036h for the latter liquid. The rice tillering branch fermentation liquid had better inhibitory effects on cyanobacteria () and green algae (,), and had the best inhibitory effect on(<0.05) . Under the stress of rice tillering branch fermentation liquid, the contents of chlorophyll a, phycocyanin (PC) and allophycocyanin (APC) ofdecreased, the autofluorescence value of algal cell chlorophyll decreased continuously, and the algal cell structure was destroyed. It was speculated that one of the anti-algae mechanisms of rice tillering branch fermentation liquid might use the photosynthetic system of algae cells as its attack target to inhibit the growth of algae, and ultimately destroy the cell structure and cause cell apoptosis.

rice tillering branches；allelopathy；algae inhibition mechanism；photosynthesis

X173;X52

A

1000-6923(2021)04-1925-07

胡春霞(1976-),女,河南信陽人,講師,博士,主要研究方向為微生物學.發表論文10余篇.

2020-09-01

國家自然科學基金資助項目(31170443)

* 責任作者, 教授, cyhztt@ahnu.edu.cn