淺低溫對心肌缺血-再灌注損傷合并膿毒癥大鼠模型的心肌保護作用

秦竹韻，申世軒，曲開勇，曹芳芳，張海濤

急性心肌梗死（AMI）與膿毒癥均是造成全球主要疾病負擔的原因[1-2]。AMI患者進行血管再通治療后合并膿毒癥在心臟重癥監護室常見。一項前瞻性研究表明，AMI合并膿毒癥的患者死亡風險較單純AMI患者顯著增加[3]。

AMI是由于冠狀動脈長時間閉塞所導致，而血流的恢復也會對心肌造成損傷。部分AMI患者因病情較重而導致住院時間延長，易發生院內感染和發展為膿毒癥。膿毒癥是宿主機體感染后所致的一系列綜合征，可導致包括心臟在內的多器官功能障礙[4]。心肌缺血-再灌注（I/R）損傷合并膿毒癥可造成心肌的氧化應激損傷、炎癥和凋亡。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）是在心肌梗死以及膿毒癥中均可產生的一種主要的活性氧物質[5-6]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可反映心肌I/R損傷合并膿毒癥中心肌炎癥情況[7]。此外，胱天蛋白酶-3（caspase-3）的表達增加可反映凋亡的發展[8]。因疾病機制復雜，心肌I/R損傷合并膿毒癥目前的臨床治療效果欠佳，目前尚少見有關其治療的文獻報道。

淺低溫（32℃～35℃）能降低機體代謝，促進損傷恢復。在動物模型中，淺低溫分別被證實可改善心肌I/R損傷和膿毒癥的癥狀[9-10]。因此，淺低溫對心肌I/R損傷合并膿毒癥可能也有保護作用。本研究通過建立SD大鼠的心肌I/R損傷合并膿毒癥疾病模型，從心功能、心肌梗死面積、心肌損傷、氧化應激、炎癥和凋亡方面探究淺低溫對心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用健康雄性SD大鼠15只，體重400～600 g，所有動物購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗前予以大鼠清潔飲食，觀察7 d，無異常反應。大鼠隨機分為3組：心肌I/R損傷合并膿毒癥淺低溫（MHT）組，心肌I/R損傷合并膿毒癥常溫（NT）組，假手術常溫組作為對照組，每組大鼠選用5只。

1.2 心肌I/R損傷合并膿毒癥模型制作

心肌I/R損傷模型按常規方法建立[11]。首先結扎前降支約30 min后抽出尼龍線使血管再通建立缺血再灌注損傷模型，然后抽出尼龍線同時將內毒素（LPS，O111B4,Sigma公司，美國）15 mg/kg腹腔注射至大鼠體內建立膿毒癥模型，對照組注射等量生理鹽水（NS）。大鼠基礎左心室收縮壓95～115 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），約15 min后下降至基礎值60%～70%左右（約60～80 mmHg）并維持1 h以上表示膿毒癥模型建立成功[12]。

1.3 溫度控制

實驗中大鼠的正常體溫在（37.0±0.5）℃，核心體溫通過檢測肛溫實現。注入LPS或生理鹽水同時，將MHT組大鼠置于冰床上降溫，每隔5 min檢測一次肛溫，15 min降至目標溫度（33.0±0.5）℃，然后維持2 h。NT組及對照組實驗全程用加熱手術臺及紅外線燈照射維持在常溫，防止大鼠因麻醉所導致的體溫丟失。

1.4 觀察指標

目標溫度維持2 h后，抽取靜脈血并處死大鼠取心臟。檢測大鼠心肌損傷標志物、心肌病理變化、心肌梗死面積、氧化應激、凋亡和炎癥的情況。

1.4.1血流動力學指標 ：實驗全程用Powerlab系統記錄心率、左心室最大收縮壓、左心室舒張末期壓力（LVEDp）、收縮期壓力最大變化速率（+max dp/dt）及舒張期壓力最小變化速率（-min dp/dt）等血流動力學指標的變化。

1.4.2心肌損傷標志物：經頸靜脈抽血用酶聯免疫吸附測定法檢測乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量。將血樣離心取上清，加樣，封板后置 37℃孵育 60 min，再洗滌、拍干，然后加入顯色劑于37℃暗處反應 20 min，終止反應后測定吸光度。

1.4.3心肌病理學變化：將大鼠結扎部位以下心肌組織放置在4%多聚甲醛溶液中固定。經乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后用光學顯微鏡觀察心肌組織病理形態學變化。

1.4.4心肌梗死面積測定：目標溫度維持2 h后，將1 ml 1%氯化三苯基四氮唑（TTC）及2 ml 1%伊文思藍注入大鼠頸靜脈將心臟染色，然后取材。粉紅色區域為梗死區，藍色為非缺血心肌區域。將心臟快速凍至-80℃ 20 min后取出，切成5個約2 mm薄片。圖片用Image Pro Plus 6.0軟件測量心肌梗死范圍，心肌梗死程度用梗死面積占總面積比例表示。

1.4.5免疫印跡法檢測NOX2表達：取 20 mg大鼠心臟組織加入裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂奶的 TBST液封閉 1 h，洗滌 3次，然后用兔抗鼠 NOX2抗體及兔抗鼠 β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（1∶2 000稀釋）孵育，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG（1∶2 000稀釋），化學發光法進行成像。β-actin作為內參蛋白。用 Image J軟件分析條帶灰度值，計算NOX2和β-actin比值作為NOX2的相對表達量。

1.4.6免疫組化檢測caspase-3和TNF-α 表達：基于HE染色結果，包含心肌梗死區域的心肌組織用石蠟包埋、封閉后，用抗TNF-α 和caspase-3抗體孵育于4℃，過夜。在室溫下用二抗孵育1 h。將3,3’-二氨基聯苯胺/過氧化氫加到切片表面，室溫染色10 min，然后成像。計算caspase-3或TNF-α 陽性細胞背景與總細胞背景的比值作為caspase-3或TNF-α 相對表達量。

1.5 統計學方法

實驗結果采用SPSS 26.0軟件進行處理，計量資料用均數±標準差（）表示。兩組間均數比較使用獨立樣本t檢驗，多組間比較使用重復測量的方差分析，兩兩比較用LSD法（方差齊時）或用Dunnett T3法（方差不齊時），非正態分布資料比較用 Kruska-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 淺低溫對血流動力學的影響（表1）

MHT組再灌注2 h心率較NT組降低[（396.63±39.93）次/min vs.（457.74±32.77）次/min，P＜0.05]；左心室最大收縮壓升高[（129.14±34.05）mmHg vs.（85.63±14.74）mmHg，P＜0.05]，差異均有統計學意義；MHT組+max dp/dt再灌注2 h較NT組及對照組升高，但差異無統計學意義；LVEDp和-min dp/dt再灌注2 h絕對值也較NT組及對照組均有所增加，但差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

2.2 淺低溫對心肌損傷的影響（表2、圖1）

NT組LDH及CK-MB顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。MHT組LDH及CK-MB均高于對照組，但差異均無統計學意義（P均＞0.05）。MHT組LDH及CK-MB均顯著低于NT組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。HE染色光鏡下MHT組心肌細胞相對完整，心肌壞死呈點狀或灶狀，心肌間質淤血程度輕且炎細胞浸潤較少。NT組的心肌出現水腫、灶狀或片狀壞死，心肌間質區淤血程度重及存在大量炎細胞浸潤。對照組心肌細胞排列整齊，結構完整。

2.3 淺低溫對心肌梗死面積的影響

對照組心肌無明顯缺血區，MHT組及NT組出現心肌梗死。MHT組與NT組相比，心肌梗死面積比率明顯減少[（11.23±2.82）% vs.（19.25±4.45）%，P＜0.05]，差異有統計學意義。

2.4 淺低溫對心肌氧化應激的影響（表3、圖2）

免疫印跡法檢查結果顯示，NT組及MHT組NOX2表達少量增加。NT組NOX2的相對表達量較對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。MHT組NOX2的相對表達量較對照組增加，差異無統計學意義（P＞0.05）。MHT組較NT組相對表達量減少，但差異亦無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠不同時間段的血流動力學數據變化（n=5，）

表1 各組大鼠不同時間段的血流動力學數據變化（n=5，）

注：NT：常溫；MHT：淺低溫；+max dp/dt：收縮期壓力最大變化速率；-min dp/dt：舒張期壓力最小變化速率；LVEDp：左心室舒張末期壓力。與對照組比較*P＜0.05；與NT組比較Δ P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

表2 淺低溫維持2 h后各組大鼠LDH和CK-MB水平比較（U/L，n=5，）

表2 淺低溫維持2 h后各組大鼠LDH和CK-MB水平比較（U/L，n=5，）

注：NT：常溫；MHT：淺低溫；LDH：乳酸脫氫酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶。與對照組比較*P＜0.05；與NT組比較△P＜0.05

圖1 淺低溫維持2 h后光鏡下各組大鼠心肌組織病理學變化（×200）

表3 淺低溫維持2 h后各組大鼠NOX2、caspase-3及TNF-a相對表達量（%，n=5，）

表3 淺低溫維持2 h后各組大鼠NOX2、caspase-3及TNF-a相對表達量（%，n=5，）

注：NT：常溫；MHT：淺低溫；NOX2：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2；caspase-3：胱天蛋白酶-3；TNF-α：腫瘤壞死因子-α。與對照組比較*P＜0.05;與NT組比較△P＜0.05

圖2 淺低溫維持2 h后各組大鼠免疫印跡法NOX2表達情況

2.5 淺低溫對心肌凋亡及炎癥的影響（表3、圖3）

免疫組化檢測NT組caspase-3及TNF-a的相對表達量較對照組顯著增高，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。MHT組caspase-3及TNF-a的相對表達量均較對照組升高，但差異均無統計學意義（P均＞0.05）。MHT組caspase-3及TNF-a的相對表達量較NT組降低，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

圖3 淺低溫維持2 h后光鏡下各組大鼠免疫組化分析中caspase-3（3A）及TNF-α（3B）的表達（×200）

3 討論

本研究成功建立SD大鼠心肌I/R損傷合并膿毒癥模型，并通過在模型中應用淺低溫證實其可改善心肌的收縮和舒張功能，減少心肌梗死面積，減輕心肌損傷，也有抗心肌氧化應激、凋亡和炎癥反應的作用。

淺低溫在其他動物實驗中已被證實有正性肌力的作用，可以改善心臟收縮及舒張功能。Huang等[13]在一項將心跳驟停的動物實驗中應用淺低溫，發現+max dp/dt、-min dp/dt和心輸出量增加，提示心臟收縮及舒張功能均有改善，本研究結果與此類似。本研究中的MHT組中，心率較前降低，但LVEDp、左心室最大收縮壓、+max dp/dt及-min dp/dt均有上升，提示大鼠的心輸出量增加。而NT組中雖然心率增加，但心臟的舒縮壓及速率均較基線減少，提示大鼠心功能受損。這證實在心肌I/R損傷合并膿毒癥中存在心功能損害，淺低溫有改善心臟收縮及舒張功能的作用。然而，MHT組及淺低溫維持2 h后+max dp/dt、LVEDp和-min dp/dt結果較NT組及對照組差異均無統計學意義，究其原因可能是因為大鼠樣本較少，或低溫時間需延長等。

既往動物實驗表明，淺低溫可減少心肌I/R損傷的梗死面積，但對于降溫時機存在爭議。Dash等[14]的一項在豬心肌I/R損傷模型研究中，降溫時機選在再灌注前30 min，結果示心肌梗死面積明顯減少。Kanemoto等[15]研究顯示，在開始再灌注時降溫，可最大限度減少心肌梗死面積。Marek-Iannucci等[16]在心肌I/R損傷豬模型中選擇再灌注后30 min降溫，心肌梗死面積也有所減少。然而，Hale等[17]在兔心肌I/R損傷模型中將降溫時機應用在再灌注后30 min，結果顯示雖然淺低溫可改善無復流現象，但心肌梗死面積并未減少。在本研究中，降溫時機在再灌注同時，MHT組的心肌梗死面積較NT組心肌梗死面積顯著減少，這與Kanemoto等[15]研究結果一致，提示即使在心肌I/R損傷合并膿毒癥的情況下，在再灌注治療同時降溫也可減少心肌梗死面積。

本研究顯示，淺低溫減少心肌梗死面積是通過減輕心肌損傷實現的。心肌損傷時，包括LDH和CK-MB在內的心肌損傷標志物釋放入循環中，LDH和CK-MB的升高可協助AMI的診斷，其升高程度可代表心肌受損程度[18]。本實驗中，MHT組中的LDH和CK-MB較NT組減低，且MHT組和對照組升高程度相比差異無統計學意義，證明淺低溫可以緩解心肌損傷。此外，在病理學層面上，HE染色直接顯示MHT組心肌受損程度較NT組明顯減輕，心肌壞死較NT組少，且炎細胞浸潤較少。

NOX2是AMI和膿毒癥中均可產生的氧化應激相關物質[5-6]。本研究顯示NOX2在MHT組較NT組表達減少，但差異無統計學意義，可能與樣本量較少有關。此外，在本實驗中，心肌I/R損傷合并膿毒癥導致提示炎癥反應的炎癥標志物TNF-α 及提示心肌細胞凋亡的caspase-3升高，而淺低溫有改善心肌炎癥及抗心肌細胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究從心功能、心肌梗死面積、心肌損傷程度、氧化應激、炎癥及凋亡幾方面證實了淺低溫在心肌I/R損傷合并膿毒癥的心肌保護作用，為臨床心肌I/R損傷合并膿毒癥的危重患者的治療提供了動物研究基礎。然而，本實驗通過注射LPS建立的膿毒癥模型與臨床上病原微生物導致的膿毒癥有區別，且大鼠與人之間物種之間的差別可導致結果不一致，故淺低溫對為臨床心肌I/R損傷合并膿毒癥患者的有效性有待進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突