MT HFR 基因不同位點突變與維吾爾族肺癌患者生存期相關性研究

商勇 周慧芳 劉勛 牙生·沙吉旦

新疆喀什地區第一人民醫院呼吸二科844000

由于人口的增長和老齡化,癌癥已成為世界范圍內的主要死亡原因[1]。肺癌是常見的癌癥之一,約占總癌癥的18.4%[2]。小細胞肺癌和非小細胞肺癌是肺癌的兩種主要病理類型。研究普遍認為,環境風險因素(如煙草和遺傳變異)與肺癌的發展有關[3-5]。已有的研究證據表明,血清中高葉酸水平對肺癌有保護作用[6-7]。葉酸代謝參與DNA 甲基化和修復過程,可能預防癌變。此外,葉酸參與的一碳代謝在癌細胞過度增殖中起到重要作 用[8-9]。5，10-亞 甲 基 四 氫 葉 酸 還 原 酶(met hylenetetrahydr of olate reductase,MT HFR)基因多態性可能調節葉酸的表達[10]。通過調節葉酸的表達,MTHFR 基因多態性被認為與肺癌的易感性有關。677C/T 和1298 A/C 是MTHFR 基因中最常見的2個單核苷酸多態性,這些單核苷酸多態性已被確定影響血清葉酸水平和MTHFR 基因活性[11],MT HFR 基因多態性與肺癌風險之間的相關性已被廣泛研究;然而,中國新疆維吾爾族人群肺癌病例中的MT HFR 基因多態性分布是否具有一定的地域差異? 本研究通過選取2018年9月至2020年9月在新疆喀什地區第一人民醫院收治的維吾爾族肺癌患者進行探究,以期從遺傳學的角度為治療維吾爾族肺癌患者提供更多的理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 前瞻性研究。選取2018年9月至2020年9月在新疆喀什地區第一人民醫院收治的維吾爾族肺癌患者50例為試驗組;選取同期在該院體檢的健康維吾爾族者50名為對照組。其中試驗組男28例,女22例;年齡(53.27±4.33)歲,年齡范圍為42～73 歲;吸煙史 (25.67±3.57)年。對照組男32 名,女18 名;年齡 (54.38±5.65)歲,年齡范圍為42～76歲;吸煙史(24.39±4.48)年。試驗組和對照組患者一般資料具有可比性(P值均＞0.05)。

納入標準:無血緣關系的喀什地區維吾爾族患者;患者生存期≥3個月,一般狀態KPS 評分≥60分,無明顯的腦、心、肺、肝、腎等主要臟器功能障礙。該研究是根據世界醫學協會《赫爾辛基宣言》進行的,并且征得各受試者的知情同意。

排除標準: (1)嚴重心血管疾病、腦血管疾病,有血栓、栓塞性疾病病史;(2)糖尿病;(3)嚴重肝腎功能不全;(4)嚴重營養不良;(5)甲狀腺疾病;(6)妊娠以及接受器官移植。

1.2 方法

1.2.1 樣本取樣 清晨采集試驗組和對照組的空腹靜脈血標本,所有的血標本在-80 ℃冰箱凍存。1.2.2 DNA 提取 采用北京百泰克生物科技有限公司生產的提取試劑盒進行DNA 抽提。首先嚴格按照說明書稀釋或者混懸各種試劑,并做好標記。然后裂解細胞,加入相應試劑純化DNA,用微量紫外分光光度計測量提取DNA 濃度及260/280的比值,260/280的比值范圍為1.8～2.0時樣本方可用于后續實驗。提取的DNA 保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 MT HFR 基因多態性檢測 MT HFR 基因上第667和1 298位的堿基容易發生點突變,采用限制性片段長度多態性酶切技術檢測2組MT HFR基因677C/T 和1298 A/C 多態性分布。引物由北京擎科生物科技公司合成,PCR Mix購自上海近岸蛋白生物科技公司。 (1)PCR 反應體系:總體積為50μl,其中模板DNA 30 ng,正向、反向引物各1.2μmol/L,Mix 25μl,加水補足至50μl。PCR 反應條件:95 ℃預變性30 s后進入熱循環,94 ℃1 min,60℃30 s,72℃1 min,循環35次,最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。667C/T 和1298 A/C的基本信息及引物序列見表1。 (2)PCR 產物酶切分析MT HFR 基因多態性:在PCR 擴增產物中加入內切酶MboⅡ(日本Takara公司,根據酶切產物的量加入相應體積酶),37 ℃金屬浴反應4 h。反應結束后,適當濃度的瓊脂糖凝膠電泳進行酶切產物檢測,進一步分析納入患者中3種基因型:野生純合型、雜合型和純合突變型。

表1 MT HFR 基因1298 A/C、677C/T 位點擴增引物

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0分析軟件進行分析,計算MT HFR 677C/T 和1298A/C 基因突變率,等位基因頻率確定維吾爾族肺癌患者中MTHFR 基因多態性。計數資料以頻數 (%)表示,組間比較采用χ2檢驗,Kaplan-Meier分析患者生存預后。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA 數據庫中肺鱗狀細胞癌和肺腺癌樣本MT HFR mRNA 的表達量分析 在TCGA 肺癌樣本數據庫中,我們發現肺腺癌樣本和肺鱗狀細胞癌樣本中MTHFR均較癌旁組織高表達(肺腺癌:t=2.391,P=0.022 3;肺鱗狀細胞癌:t=2.426,P=0.020 5),見圖1。

圖1 MTHFR 在TCGA 數據庫中表達量的分析

2.2 肺癌患者中MTHFR 的表達和患者生存預后分析 進一步通過對MT HFR 的表達量和肺癌患者的預后生存進行分析,結果發現低表達的MT HFR 有助于肺癌患者的生存預后,高表達MTHFR 不利于患者的預后,見圖2。

圖2 MT HFR 的表達與肺癌患者生存預后的關系

2.3 MT HFR 677C/T 基因型頻率及等位基因頻率 如表2所示,試驗組中MT HFR 677CC 基因型頻率為26.0%,677CT 基因型頻率為42.0%,677TT 基因型頻率為32.0%;對照組中MT HFR 677CC基因型頻率為68.0%,677CT 基因型頻率為20.0%,677 TT 基因型頻率為12.0%,組間比較差異均有統計學意義 (P值均＜0.05)。試驗組T 等位基因分布頻率高于對照組,C等位基因分布頻率則相反,差異均有統計學意義 (χ2=4.352、8.647,P值均＜0.05)。

表2 MT HFR 667C/T 基因型及等位基因的分布頻率 [頻數 (%)]

2.4 MT HFR 1298 A/C基因型頻率及等位基因頻率 如表3 所示,試驗組中MT HFR 1298 AA 基因型頻率是30.0%,1298 AC 基因型頻率是38.0%,1298CC基因型頻率是32.0%;對照組中MT HFR 1298 AA 基因型頻率是64.0%,1298 AC基因型頻率是22.0%，1298CC 基因型頻率是14.0%,組間比較差異均有統計學意義 (P值均＜0.05)。試驗組C 等位基因分布頻率高于對照組,差異有統計學意義 (51.0%比25.0%,χ2=4.424,P＜0.05)。

3 討論

近年來,癌癥發生、發展中的遺傳易感性位點的研究取得了一定的進展,但是肺癌的遺傳因素還未能夠完全闡明。本研究對維吾爾族人群中50例肺癌患者和50名健康對照者MT HFR 基因的多態性位點進行檢測,分析其多態性在肺癌患者以及健康人群中發生的頻率以及通過TCGA 數據庫進一步檢測該基因在肺腺癌以及鱗狀細胞癌中的表達水平和對肺癌患者生存預后的影響。TCGA 數據庫顯示肺腺癌和肺鱗癌患者中MT HFR 高表達,與低表達組相比,高表達MT HFR 的肺癌患者生存預后較差,表明MT HFR 和MT HFR 基因多態性可能與維吾爾族人群肺癌風險密切相關。

采用限制性片段長度多態性酶切技術檢測試驗組和對照組患者MTHFR 基因677C/T 和1298A/C多態性,以及組間該基因發生多態性的頻率。如表1所示,試驗組MT HFR 677C/T 野生純合型基因型 (CC)的分布頻率為26.0%,而對照組為68.0%,顯著高于試驗組;試驗組MTHFR 677C/T雜合突變型基因型 (CT)的分布頻率為42.0%,而對照組為20%;試驗組MTHFR 677C/T 純合突變型基因型 (TT)的分布頻率32.0%,而對照組為12.0%;試驗組和對照組的肺癌患者T 等位基因分布頻率分別為53.0%和22.0%,試驗組中T等位基因分布頻率高于對照組,以上各項組間比較差異均有統計學意義 (P值均＜0.05)。這與Liu等[11]的研究結果具有一致性,肺癌患者的MT HFR 677C/T 純合突變型基因型較多。章婷等[10]卻得出了相反的結論,認為T 等位基因可能降低肺癌的發病風險。以上研究結果提示在不同種族人群中,MT HFR 基因單核苷酸多態性可能與遺傳學背景和環境等因素有關。雖然本研究的研究對象均為維吾爾族人群,但是納入對象可能來自不同的地區,存在一定的地區差異,可能會影響實驗結果。

此外,本研究還發現試驗組MT HFR 1298 AA型患者有30.0%,MTHFR 1298 AC 型患者有38.0%,MT HFR 1298CC 型患者有32.0%,對照組分別為64.0%、22%和14.0%,組間比較差異均有統計學意義(P值均＜0.05),但仍需更大的樣本量證實這一推論。MTHFR 基因變異引起肺癌的機制可能與DNA 和RNA 的甲基化異常有關[11-14]。MT HFR 是葉酸代謝途徑中的限速酶,催化葉酸代謝產物5，10-亞甲基四氫葉酸轉變為5-甲基四氫葉酸,前者可進一步合成核苷酸,而后者是合成體內通用甲基供體S-腺苷甲硫氨酸的原料之一[15-16]。MT HFR 基因變異致酶活性降低,5-甲基四氫葉酸水平低下,S-腺苷甲硫氨酸的合成減少,進一步引起基因組的異常甲基化[17-19]。綜上所述,本研究顯示MTHFR 基因677C/T 和1298A/C的單核苷酸多態性在維吾爾族人群肺癌中較常見;同時MTHFR 在肺癌組織中高表達,影響患者的生存預后。因此本研究提示MT HFR 基因的多態性與維吾爾族人群肺癌的發生存在一定關系,MT HFR 有望作為篩選肺癌高危人群靶向分子,也可作為臨床早期發現肺癌的預測因子。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

表3 MT HFR 1298 A/C基因型及等位基因的分布頻率 [頻數 (%)]