miR-23b通過靶基因Cxcl12調控腎性高血壓*

李 響，于閃閃，胡艷玲，王天賀，李洪志，趙冰海，邱德來，王會巖

（1延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室，吉林延吉 133002；2吉林醫藥學院，吉林吉林 132013；3北華大學基礎醫學院，吉林吉林 132013）

腎性高血壓是一種常見的繼發性高血壓，腎臟實質性病變和腎動脈病變是引起腎性高血壓的主要原因。腎性高血壓占成年人高血壓的5%，占未成年人高血壓的60%，腎功能不全的患者發生高血壓占58%～86%［1］。腎臟病變導致高血壓的發生，而高血壓的發生又對腎臟再次損害，二者相互促進使疾病不斷發生發展，這種惡性循環對高血壓的治療造成了極大的困難［2］。綜上所述，腎性高血壓嚴重地威脅人類的身體健康，因此，如何快速有效的提高腎臟功能、降低血壓是防治腎性高血壓的關鍵。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長度約為21～23 個核苷酸的非編碼的調控小RNA，它們通過與mRNA 結合，在轉錄后水平調控靶基因表達［3］。大量研究表明，一個miRNA 可與多個靶基因結合，而同一個靶基因又可受多個miRNA 調控，這些靶基因都可以發揮轉錄因子、轉錄蛋白、分泌因子及受體等生物學功能［4］。miRNA 在生物進化過程中高度保守，在細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化、脂類代謝、激素分泌及在腫瘤等多種疾病的發生發展中扮演著重要角色［5］。近年來越來越多的研究發現，miRNA 參與冠狀動脈粥樣硬化心臟病、高血壓、心肌肥厚和心律失常等心臟疾病的發生、發展機制［6］，在心血管系統疾病及微血管病變中具有重要作用［7］。miRNA 主要功能為降解、穩定、促進靶基因表達，我們在近幾年對miRNA 生物功能研究中發現，給予野生型小鼠特異性miR-23b 抑制劑可導致腎臟纖維化［8］，但這種腎臟纖維化來源于何種類型的腎臟疾病并不清楚，因為腎臟纖維化是大多數腎臟疾病的終末病理變現，為了更加深入定位miR-23b 在腎臟疾病中的功能，我們利用CRISPRCas9 技術在小鼠體內敲除miR-23b進而研究其作用。本研究通過基因敲除小鼠和臨床腎臟病理活檢樣本，討論miR-23b 在腎性高血壓中的調控作用，為研究腎性高血壓的發生機制與臨床診斷提供研究基礎。

材料和方法

1 臨床樣本采集

本研究所有臨床樣本收集于吉林市中心醫院及北華大學附屬醫院，包括腎病綜合征患者腎活檢，健康人群腎活檢。臨床樣本在低溫條件下30 min 之內送到實驗室且-80℃保存。

2 實驗動物和分組

選取8 周齡雄性C57BL/6（野生型，wild-type，WT）小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006；miR-23b基因敲除（miR-23bgene knockout，miR-23b KO）小鼠由北華大學基礎醫學院趙冰海教授饋贈。小鼠體重均在24～26 g，在IVC 級動物房飼養，光照與黑暗12 h 自動轉換，溫度24～25℃，濕度55%，飲食攝水自由，所用飼料和墊料均購自北京科奧協力飼料有限公司。實驗分為WT 小鼠和miR-23b KO 小鼠共2 組，每組6 只。尿液樣品用小鼠代謝籠收集24 h尿液。小鼠血清樣本采用眼球取血至抗凝管，4 000 r/min 離心10 min，取上清低溫保存。小鼠斷頸處死，獲取腎臟，取1/2皮質部分保存4%多聚甲醛溶液用于石蠟包埋，剩余的腎臟組織冰凍液氮保存。

3 方法

3.1 腎臟組織切片和形態學觀察

3.1.1 HE 染色 將切片置于62℃烘箱中2 h，二甲苯脫蠟10 min，100%乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸餾水5 min，60℃預熱的蘇木素2 min，流水沖洗20 s，促藍返藍（0.5%鹽酸乙醇）40 s，流水沖洗20 s，1%伊紅溶液1 min，流水沖洗20 s，乙醇梯度脫水，二甲苯透化2 min，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照。

3.1.2 高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色 按照PAS Stain Kit（Abcam）說明書操作。

3.1.3 免疫組化染色 將切片置于62℃烘箱中2 h，二甲苯脫蠟10 min，100%乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸餾水5 min，0.25%TritonX-100（Sigma）透化10 min，2%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，Ⅰ抗4℃過夜，PBS 洗3 遍，每次5 min，Ⅱ抗37℃孵育1 h，PBS 洗5 min×3 遍，DAB 顯色10 min，PBS 洗3 遍，乙醇梯度脫水，二甲苯透化2 min，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照。

3.2 ELISA 實驗 以腎素（renin）為例，取6 μL 血清與50 μL coating buffer（Abcam）混勻，4℃包被過夜，PBST 洗3 遍，2%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，Ⅰ抗37℃孵育1 h，PBST 洗4 遍，Ⅱ抗37℃孵育30 min，PBST洗4遍，ECL顯色，酶標儀化學發光檢測。

3.3 RT-qPCR 檢測RNA 表達 用Trizol RNA 提取試劑盒（Invitrogen）提取小鼠腎臟RNA，NanoDrop 測濃度。以提取的RNA 作為模板，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）對RNA 進行逆轉錄，PCR 體系為1 μg RNA；Anchored-Oligo（DT）18 Primer 1 μL；Random Hexamer Primer 2 μL；PCRgrade Water 至13 μL。反應條件為：60℃10 min，立即冰上靜止10 min。5×buffer 5 μL；protector RNase inhibitor 0.5 μL；Deoxynucleotide Mix 2 μL；Tran?scriptor Reverse Transcriptase 0.5 μL；總體積20 μL。反應條件為：25℃10 min、50℃60 min，將RNA 逆轉錄為cDNA。使用Primer Premier 5.0 軟件設計基因對應的引物，qPCR 反應體系為2×SYBR Green Mas?ter Mix 10 μL、Forward primer 0.8 μL、Reverse primer 0.8 μL、cDNA template 2 μL、RNase-free H2O 至20 μL。反應條件為：預變性95℃5 min；變性90℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，45 個循環，再延伸72℃5 min。鼠源內參照GAPDH 的正向引物序列為5'-ATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3'，反向引物序列為5'-TCCTTGGAGGCCATGTAGG-3'；鼠源Cx?cl12基因正向引物序列為5'-TGCATCAGTGACGG?TAAACCA-3'，反向引物序列5'-CACAGTTTGGAGT?GTTGAGGAT-3'。人源內參照GAPDH 的正向引物序列為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向引物序列為5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'；人源Cxcl12基因的正向引物序列為5'-ATTCTCAA?CACTCCAAACTGTGC-3'，反向引物序列為5'-ACTT?TAGCTTCGGGTCAATGC-3'。

3.4 雙螢光素酶報告基因實驗 根據NCBI 數據庫中Cxcl12的序列信息，設計擴增引物，正向引物為5'-ATTCTAGTTGTTTAAACGAGCTCCATGCTTCATCT?GACTTCCGCTTCT-3'，反向引物為5'-GCTTGCAT?GCCTGCAGGTCGACTCTAGAATCCCCACTGTG?GCTTCATGGCAAG-3'，PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并純化，經酶切將基因Cxcl12序列連接到pmir?GLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector（Promega）上，測序提質粒，實驗分為GLO 對照組、GLO-Cxcl12+miR-23b（+）組、GLO-Cxcl12+miR-23b（-）組和GLO-Cxcl12+miRNEG 組，轉染到293T 細胞中，轉染48 h 后，按照Dual-Glo?Luciferase Assay Sys?tem（E2920）說明操作進行螢光素酶活性測定。

3.5 腎臟樣本的RNA 測序（RNA sequencing，RNASeq）建庫與生物信息學分析 本實驗通過Illumina的NEBNext RNA 文庫制備試劑盒說明書制備測序文庫（New England Biolabs）。RNA-Seq 數據可在NCBI GEO網站的登錄查詢，登錄號為PRJNA524723。

4 統計學處理

本研究所得實驗數據運用SPSS 21.0 軟件進行分析。實驗數據以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩組間比較采用Bon?ferroni檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 從臨床樣本角度檢測miR-23b 表達與腎病綜合征的關系

用RT-qPCR 方法，對收集的臨床腎病綜合征患者和健康人的腎活檢樣本進行miR-23b 表達量的檢測，與健康人群組（739.74±335.20，n=6）相比較，腎病綜合征患者組miR-23b 在腎臟活檢樣本中的表達量（50.71±47.56，n=6）顯著降低（P＜0.01）。對腎病綜合征患者的血清肌酐（serum creatinine）、尿酸（uric acid，UA）及24 h 尿蛋白（urine protein）與miR-23b 表達量進行相關分析發現，前3 個指標都與miR-23b的表達呈負相關（P＜0.05），見圖1A。

2 實驗動物各組織器官miR-23b表達量檢測

為了確保實驗動物基因敲除成功，對miR-23b KO 小鼠進行基因型鑒定，正向引物為5'-TG?GTCCCTAAGGTATTGGTCTCAT-3'，反向引物為5'-TTGTTTCCAAAGAGCCACAAGG-3'，PCR 產物的電泳結果見圖2。用Bulge-LoopTMmiRNA RT-qPCR Starter Kit（廣州銳博生物技術有限公司）來檢測miR-23b KO 小鼠和WT 小鼠的各組織器官miR-23b 表達水平，結果顯示，與WT 組相比，miR-23b KO 小鼠各組織器官miR-23b 表達均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），見表1。

3 miR-23b基因敲除小鼠腎臟結構及功能改變

Figure 1.Relationship between miR-3b expression and renal function.A：the correlation between miR-23b expression level and se?rum creatinine level；B：the correlation between the expression of miR-23b and 24-hour urine protein；C：the correlation between the expression level of miR-23b and serum uric acid（UA）.圖1 miR-23b表達水平與反映腎臟功能指標的關系

Figure 2.Genetyping of miR-23b mice.M：Marker DL2000；Lane 1―9：miR-23b KO mice（target fragment 267 bp）；Lane 10：WT mice（target fragment 359 bp）.圖2 miR-23b KO小鼠基因型的鑒定

表1 miR-23b KO小鼠中miR-23b的表達Table 1.The expression of miR-23b in miR-23b KO mice（Mean±SD. n=6）

24 h 尿蛋白測定是早期判定腎臟出現病變的常見手段，我們通過ELISA（Assaypro，Mouse Albumin ELISA Kit）檢測2 組小鼠24 h 尿液中微量白蛋白含量，結果顯示，與WT 組比較，miR-23b KO 組小鼠尿微量白蛋白顯著升高（P＜0.01），提示miR-23b KO 小鼠腎臟發生損害，見表2。我們又通過腎臟磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和彩色多普勒血流成像（color Doppler flow imaging，CDFI）來進一步驗證。腎臟MRI 顯示，與WT 組相比，腎臟皮質變薄而且皮髓質交界模糊，測得miR-23b KO 組小鼠的腎皮質顯著變薄（P＜0.05），預示腎臟已經發生病變；CDFI 顯示，與WT 組比較，測得miR-23b KO 小鼠腎臟血管阻力指數顯著升高（P＜0.01），而腎臟血管阻力指數的變化是高血壓的一個重要特征，見圖3及表2。

我們對2 組小鼠腎臟組織切片進行HE 和PAS染色及纖維連接蛋白（fibronectin，FN）免疫組化，結果發現，miR-23b KO 小鼠相比WT 小鼠出現腎小球系膜區擴張、腎小球FN 沉積增加和糖原增多等形態學改變，進一步驗證了miR-23b 在腎臟中的重要作用，見圖4。通過ELISA 檢測2 組小鼠血清中腎素和血管緊張素水平，與WT 組比較，miR-23b KO 小鼠腎素和血管緊張素均顯著增高（P＜0.05），見表2。

4 miR-23b 基因敲除小鼠腎臟組織RNA-Seq 基因的變化

對2 組小鼠進行RNA-Seq，發現非靶基因上調176 個，下調184 個，靶基因上調11 個，下調9 個，見表3。miR-23b 靶基因顯著改變有20 個，非顯著改變有709 個，非靶基因顯著改變有340 個，非顯著改變有24 279 個，見表4。miR-23b KO 小鼠腎臟總體變化基因富集于血流（綠色標注），腎臟總體變化基因與TargetScan 數據庫中的miR-23b 靶基因有交集，并且這些基因富集于血流，見圖5。

5 miR-23b靶定Cxcl12發揮生物學作用

根據上述生物信息學分析，Cxcl12（miR-23b 靶基因）是與血流關系最密切的基因，對臨床上收集的腎病綜合征病患者和健康人的腎活檢樣本進行RTqPCR，與健康人群組相比，腎病綜合征患者Cxcl12基因表達水平顯著增高（P＜0.01），見圖6A。同時，對2 組小鼠腎臟組織進行RT-qPCR，與WT 小鼠比較，miR-23b KO 小鼠的Cxcl12基因表達也發生顯著增高（P＜0.05），見圖6B。這些研究結果表明miR-23b的表達與Cxcl12基因呈負相關。

Figure 3.Renal magnetic resonance imaging（MRI）and color Doppler flow imaging（CDFI）.Representative images of MRI and CDFI from miR-23b KO mice and WT mice showed that deletion of miR-23b induced renal hypertension.圖3 腎臟磁共振成像和彩色多普勒血流成像

Figure 4.Representative images of HE staining，periodic acid-Schiff（PAS）staining and immunochemistry for fibronectin（FN）in mouse kidney（×400）.圖4 小鼠腎臟HE、PAS和FN免疫組化染色

表2 miR-23b KO小鼠尿微量白蛋白、血管阻力系數、腎皮質厚度和血清中腎素-血管緊張素的檢測結果Table 2.Detection of urine microalbumin，vascular resistance coefficient，renal cortex thickness，and the serum levels of renin and angiotensin in the miR-23b KO mice（Mean±SD. n=6）

表3 WT 和miR-23b KO 小鼠腎臟RNA-Seq 后相關基因的變化Table 3.Changes of related genes in the kidneys of WT and miR-23b KO mice by RNA-Seq（n=6）

表4 WT 和miR-23b KO 小鼠腎臟RNA-Seq 相關基因與TargetScan數據庫對比Table 4.Comparison of the kidneyrelated gene expression in the WT and miR-23b KO mice detected by RNA-Seq with the results of TargetScan database（n=6）.

為了近一步檢測miR-23b是否調控Cxcl12基因，我們進行體外螢光素酶報告基因實驗，與WT 組比較，發現miR-23b過表達時可以顯著抑制Cxcl12螢光素酶活性（P＜0.01），而對miR-23b KO 和類似物實驗時沒有發生抑制，見圖7。這些研究數據表明miR-23b通過調控靶基因Cxcl12發揮其生物學作用，進而調控小鼠血壓的變化。

討論

腎性高血壓是腎臟發生病變引起的高血壓，是慢性腎臟病最常見的并發癥，隨著腎臟的病變，高血壓的發病率不斷增加，近而對腎臟再次造成傷害。對于腎性高血壓的治療不僅要控制血壓、還要延緩腎臟損傷［2，9］。目前，肥胖、高血脂癥、糖尿病和吸煙等都是腎性高血壓的誘因，由于腎性高血壓的發生發展機制過于復雜，所以預防和治療面臨著一定的困難［10］。

Figure 5.KEGG database analysis of RNA-Seq results in the kidney of miR-23b KO mice.A：GO term enrichment analysis for global altered genes from miR-23b KO mice kidney，which showed that heart contraction and blood circulation were en?riched terms；B：GO term enrichment analysis for global changed genes overlapped with miR-23b target database，which showed that significantly altered miR-23b target genes were enriched in blood circulation.圖5 miR-23b KO小鼠腎臟RNA-Seq結果的KEGG數據庫分析

Figure 6.The mRNA expression of Cxcl12 gene in healthy controls，nephrotic syndrome（NS）patients（A），WT mice and miR-23b KO mice（B）.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 healthy；##P＜0.01 vs WT.圖6 健康人群與腎病綜合征患者及miR-23b KO 小鼠Cx?cl12基因檢測

Figure 7.Luciferase reporter experiment.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT group.圖7 雙螢光素酶報告實驗

自從發現miRNA 以來，越來越多的證據表明它們在各種疾病中起著重要作用，包括糖尿病和腎功能不全等［11］。此外，足細胞特異性敲除Dicer（一種參與miRNAs處理的必需酶）會導致小鼠的腎小球和腎小管發生損傷［12-13］。miR-192/216a/217［14］、miR-200a［15］和miR-29a/b/c［16］等參與糖尿病腎病的發生發展。另外，miR-23b已被證明是腫瘤和一些炎癥過程中免疫反應的重要調節因子［17-18］，miR-23b 在免疫炎癥疾病以及腫瘤疾病中的表達會降低，可以抑制腫瘤細胞擴散［17，19-20］。在本研究中，我們發現腎病綜合征患者無論是血清還是腎臟組織中的miR-23b 的表達水平都顯著降低。在miR-23b基因敲除小鼠上發現尿蛋白增高、腎小球系膜區擴張、腎小球纖維粘連蛋白沉積增加、腎皮質變薄等腎臟組織形態學上的改變，以及腎臟血管阻力指數顯著增高、激活腎素-血管緊張系統發生高血壓。RNA-Seq 測序發現腎臟總體變化基因富集于血流方面，腎臟總體變化基因與TargetScan 數據庫中miR-23b 靶基因交集的顯著變化富集于血流方面。根據上述生物信息學分析，Cxcl12是與血流關系最密切的基因［21-22］，為了進一步闡明miR-23b 調節高血壓的機制，我們采用RTqPCR 方法，發現臨床腎病綜合征患者的Cxcl12的表達變化與miR-23b KO 小鼠相同。這些數據強烈地提醒我們miR-23b 可調控Cxcl12基因。我們進行體外螢光素酶檢測miR-23b是否調控靶基因Cxcl12，發現miR-23b 過表達時可以顯著抑制Cxcl12螢光素酶測定。因此，我們更加確定miR-23b 通過調控靶基因Cxcl12發揮其生物學作用。

研究證實了抑制miR-23b 的表達可以促進Cxcl12的升高，同時，miR-23b 通過調節靶基因Cxcl12影響腎性高血壓。研究表明miR-23b 可能成為治療腎性高血壓的一種有效的治療方法。雖然對于腎性高血壓的發生發展機制有很多的理論解釋，但是miRNA 在腎性高血壓的確切發生機制仍未完全闡明，在腎性高血壓中，影響Cxcl12的表達會通過怎樣的信號轉導發揮作用還需要在以后的研究中進一步驗證。本文的研究結果為后續發現診斷、治療腎性高血壓的標志物提供了有力的理論依據。