基于冷凍電子顯微術的陽離子通道結構與功能研究進展*

蔣璐璐，高 巨

（1中南大學湘雅二醫院麻醉科，湖南長沙 410011；2江蘇省蘇北人民醫院麻醉科，江蘇揚州 225001）

陽離子通道通過疏水性脂質生物膜介導陽離子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+等）的流動，從而調節神經元、肌肉細胞等可興奮細胞及淋巴細胞、內皮細胞等非可興奮細胞的膜電位變化、Ca2+信號轉導及其他各種細胞生物學過程［1］。根據國際基礎與臨床藥理學聯合會（International Union of Basic &Clinical Pharmacolo?gy，IUPHAR）藥理學指南，人類基因組包含145 個電壓門控通道［2］、55 個配體門控通道［3］和27 個其他類型通道［4］，如連接蛋白、Piezo、鈣庫操縱性鈣通道等，負責陽離子跨膜運輸。當編碼陽離子通道的基因或相關支架蛋白的基因發生突變時，會引起相關的離子通道病，如囊性纖維化［5］、長QT 間期綜合征［6］、癲癇［7］等。這些通道在發揮其特定生理功能的同時，也成為治療不同疾病的藥物作用靶點。本文就近年來有關陽離子通道的最新研究進行綜述，以更深入地了解離子通道的門控機制。

1 陽離子通道結構研究的新進展

近年來，隨著冷凍電子顯微術（cryo-electron mi?croscopy，Cryo-EM）的發展，成像硬件的改進，顯微鏡圖像處理能力增強，大量離子通道的三維結構得以重建。由于X 射線晶體衍射或核磁共振波譜分析等傳統方法，難以獲得G 蛋白偶聯受體和離子通道等膜蛋白高分辨率結構，因此，Cryo-EM 越來越多地用于獲取膜蛋白分子的原子級分辨率結構［8］。Doyle等［9］于1998 年首次闡明細菌K+通道KcsA 的結構。他們又于2016 年描繪出電壓門控型K+通道Eag1（KV10.1）的結構，揭示出一種新的電壓依賴性調節機制［10］。此后，又有研究者運用Cryo-EM研究了多個離子通道的結構-功能關系，如hERG［11］、KCNQ1［12］、超極化激活的環核苷酸門控通道1（hyperpolariza?tion-activated cyclic nucleotide-gated channel 1，HCN1）［13］、Slack（Slo2.2）［14］、Kir6.2［15］、KCa1.1［16-17］和KCa3.1（SK4）［18］，為理解不同類型離子通道的門控機制提供了新的見解。目前基于Cryo-EM 技術已解析多個陽離子通道的高分辨率結構，見圖1。

Figure 1.Cation channels whose high-resolution structures have been resolved based on Cryo-EM.圖1 基于冷凍電鏡技術解析其高分辨率結構的陽離子通道

1.1 HCN HCN 是一類非選擇性陽離子通道，同時允許Na+和K+通過，在心臟起搏和中樞神經系統中發揮重要作用。該家族4 個成員均為電壓門控型，且受內源性環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophos?phate，cAMP）的調節。Lee［13］在3.5 ? 分辨率下解析了HCN1 的結構，并闡釋其Na+/K+通透比為4∶1。他還觀察到HCN1 結構中S4 螺旋可延伸至胞質內，穩定通道關閉狀態。此結構揭示了HCN 門控機制中電壓依賴性的反極性，即當膜發生超極化時，由于S4螺旋向下位移破壞其穩定作用，從而開放通道。而cAMP 的結合也可引起通道內螺旋的旋轉，從而使通道處于開放狀態。

1.2 鈣激活鉀通道和鈉激活鉀通道 鈣激活鉀通道KCa3.1（SK4）廣泛表達于免疫系統，可與鈣調蛋白結合形成復合物。MacKinnon 及其研究團隊分別在3.4 ?和3.5 ?分辨率下獲得該通道關閉與激活狀態構象。他們發現，當環境中沒有鈣時，鈣調蛋白C 端半段結構（C-lobe）可結合于通道鈣調蛋白結合域C端。另外，盡管目前仍不清楚鈣調蛋白N 端半段結構（N-lobe）的具體作用，但當KCa3.1 處于激活狀態時，N-lobe 擺動至通道另一亞基S4-S5 linker，并將其下拉，導致S6 向外移動，從而擴大通道開放孔徑，這可能是影響KCa通道門控機制的關鍵所在，同時也可能成為潛在的藥物靶點［18］。長期以來，離子通道結構的對稱性一直存在爭議，而KCa3.1 結構表明KCa通道為對稱的四聚體結構，而非先前提出的二聚體對稱結構。此外，Hite 等［19］同樣運用Cryo-EM 技術，通過滴定Na+濃度，在鏡下觀察到鈉激活鉀通道Slack（Slo2.2）的多種構象變化。Slack 主要表達于神經元內，可被胞內高濃度Na+激活。結合前期關于Slack結構的研究，Hite［14］設置了5 種不同濃度Na+梯度進行滴定，電鏡成像結果顯示Slack 關閉狀態存在多種構象，而僅有一種開放狀態構象，且呈Na+濃度梯度依賴性，這表明該配體門控通道的開放是高度協調、類似開關的過程。

1.3 瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道家族 TRP通道是一類重要的非選擇性陽離子通道，可允許Na+、Ca2+和Mg2+通過，是體內多種生理過程的感受器。目前，已有多種TRP 通道的結構得以解析，見圖2。（1）Singh 等［20］不僅獲取了小鼠瞬時受體電位V 型通道3（transient receptor potential vanilloid 3，TRPV3）關閉狀態的結構，同時給予激動劑2-氨基乙氧基-二苯基硼酸（2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB）使通道開放，并闡明了其激活狀態結構。2-APB 可結合于通道3個不同的變構位點，當通道開放時，胞外孔及胞內段均發生構象變化。TRPV3 過度活化是皮炎發生瘙癢與疼痛的重要機制，深入了解其結構-功能關系有望為此疾病提供新的治療靶點。（2）瞬時受體電位M 型通道8（transient receptor potential melastatin 8，TRPM8）是人體內重要的冷感應蛋白。Yin 等［21］在4.1? 分辨率下獲得其高清結構時發現，該通道不僅與其他TRP 通道具有相同的同源四聚體結構，且N 端結構域具有獨特的折疊模式。同時，該通道可與薄荷醇結合，不同于其他配體結合位置，此結合位點位于電壓傳感器樣結構域內。（3）TRP通道家族中另一重要成員經典型瞬時受體電位通道3（transient receptor potential canoni?cal 3，TRPC3）是一種Ca2+通道，其編碼基因突變可導致人類罹患神經退行性疾病和心血管疾病［22］。Cryo-EM圖像分析顯示，人源TRPC3擁有與其他TRP通道相似的跨膜結構域，其胞質結構域（cytoplasmic domain，CPD）可穩定通道結構，并參與通道門控調節。Sierra-Valdez 等［23］對TRPC3 結構的闡明有助于我們理解TRP 通道的門控機制，研究人員觀察到TRPC3 的CPD 中水平螺旋可與跨膜結構域偶聯，當水平螺旋轉變為卷曲螺旋束時，可促進通道構象改變，進而影響通道門控狀態。

Figure 2.Three-dimensional cryo-electron microscopic reconstruction and structure of TRPV3，TRPM8 and TRPC3 viewed from the extracellular side（left）and the membrane plane（right）［20-21，23］.圖2 冷凍電鏡下TRPV3、TRPM8和TRPC3離子通道結構

常染色體顯性遺傳性多囊腎病（autosomal domi?nant polycystic kidney disease，ADPKD）是慢性腎病的重要誘因之一，其致病基因為Pkd1和Pkd2，分別編碼膜蛋白PKD1 和PKD2。PKD1 是典型的電壓門控型離子通道，不同于目前已知的電壓依賴性離子通道折疊蛋白，它可與PKD2結合形成具有域交換的非典型TRP 通道。Su 等［24］首次報道了PKD1 和PKD2 復合物近原子級分辨率（3.6 ?）的冷凍電鏡結構。該研究顯示，盡管PKD1 和PKD2 蛋白C 端沒有卷曲螺旋結構域，二者仍能以1∶3 的比例形成獨特的復合物。此外，研究人員還發現，PKD1 的S6 片段可從中間分裂，胞外段S6a形成類似于典型的孔螺旋結構，而胞內段則呈現無規則卷曲；且S6 跨膜螺旋上存在3 個帶有正電荷的氨基酸殘基，當其伸入通道中心孔時，可使通道處于非導電狀態。

1.4 機械敏感性Piezo1通道 Piezo1是近年發現的一種新型機械敏感性離子通道，由Piezo1基因編碼而成。研究發現，Piezo1表達于神經系統、血管內皮、膀胱、肺組織等，在神經軸突生長、血壓調節、膀胱內壓力感知及肺損傷中發揮重要的機械轉導作用［25］。早期對Piezo1低分辨率結構的研究顯示，Piezo1是具有38 個跨膜結構域的膜蛋白，以中央帽為中心，周圍呈三葉螺旋槳樣結構。外葉作為壓力感受器可感知周圍環境壓力的變化，并調控通道中央孔陽離子的運輸［26］。Zhao 等［27］最近分析了約3×106個粒子的結構后，得到了Piezo1 的高清結構（3.97 ?）。該結構顯示通道胞內段中心存在一個90 ? 的橫梁，橫梁通過杠桿樣運動，將跨膜螺旋與中心孔聯結起來。此結構是Piezo1 感知機械力后激活的基礎：外葉感知機械力后發生卷曲，橫梁發生杠桿樣運動，使中心孔發生構象改變，進而允許Ca2+通過。Piezo1 結構的闡明及其獨特的門控機制不同于目前已知的其他離子通道，為我們理解離子通道結構-功能關系提供了新的視角與見解，見圖3［28］。

Figure 3.Cryo-electron microscopic structure of mouse Piezo1［28］.The dimensions of the trimeric structure，the height of the cap and the length of the beam are indicated.圖3 冷凍電鏡下小鼠Piezo1的結構

1.5 上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）近年Noreng 等［29］解析了ENaC 的冷凍電鏡結構。ENaC 負責調節體內水鈉平衡，多數鈉通道均是電壓門控型，通常由帶有4 個重復結構域的大α 亞基組成，而ENaC 則為異源三聚體結構，且其中包含一個蛋白酶敏感結構域，參與調控通道門控狀態［30］。ENaC 由α、β和γ亞基組成，3種亞基按照1∶1∶1的比例以逆時針方向排列，亞基之間存在蛋白酶敏感的抑制性結構域。此結構的發現不僅明確了ENaC 的化學組成及排列方式，同時有助于揭示通道失活的相關機制。

1.6 雙孔通道家族（two-pore channels，TPCs）TPCs是一類具有2個孔的離子通道。其中TPC1是選擇性Na+通道，表達于細胞內體（一種膜包裹的酸性、不含溶酶體酶的囊泡結構，分為初級內體和次級內體；初級內體通常位于細胞質的外側，次級內體常位于細胞質的內側，靠近細胞核），對于調節嗜酸性細胞器（如線粒體、溶酶體等）的生理功能具有重要作用。She 等［31］發現，不同于雙孔鉀通道（two-pore potas?sium channel，K2P），TPC1 是由2 個6 次跨膜亞基（six-transmembrane，6-TM）組成的同源二聚體，其N端和C端均位于膜胞質面。TPC1不僅具有電壓依賴性，同時也可通過一個6-TM 中的磷脂酰肌醇3，5-二磷酸與另一個6-TM 相結合以感應電壓變化，進而激活通道。

1.7 其他陽離子通道 除了上述陽離子通道，新近有2 個電壓門控型鈉通道［NaV，即人源NaV1.4-β1 復合物（3.2 ?）［32］和昆蟲NaVPaS（2.8 ?，與河豚毒素結合時為2.6 ?）［33］］的結構被闡明，不僅為動物毒素調控離子通道的機制提供了理論依據，同時將有助于推動新型動物毒素相關藥物的研發。Cuello 等［34］通過運用傳統的X 射線晶體衍射技術及一組巧妙交聯的通道突變體揭示了KcsA 通道的門控特性。KcsA通道存在3 種狀態，即關閉、開放和C 型失活（慢失活），越來越多的電壓依賴型鉀通道被發現存在C 型失活狀態，其機制較為復雜，目前主要認為是由于通道外口阻滯及通道K+離子選擇器對K+的通透能力降低所致，該通道高清結構（2 ?）的解析為了解通道選擇性通過膜如何隨門控狀態的變化而變化提供了新的結構依據。

2 陽離子通道生理學和病理生理學研究新進展

陽離子通道允許Na+、K+、Ca2+等陽離子進出細胞膜以調節膜電位，主要分為電壓門控型和配體門控型兩大類。近年來，隨著研究的不斷深入，研究者們陸續發現了其他調控機制的離子通道，如機械敏感性離子通道Piezo，在血壓調節和肺牽張反射中發揮重要作用［35］。此外，人們也越來越關注一些功能性通道亞基，及細胞器（如線粒體）陽離子通道的生物學功能。

2.1 機械敏感性Piezo 通道 機械轉導是將壓力、牽引力、剪切力等機械刺激信號轉化為電信號或生物化學信號，并最終引起細胞生理反應的過程，在動植物進化過程中呈高度保守。盡管人們早已認識到機械轉導在多種生理過程中發揮至關重要的作用，如植物根莖的形成［36］，原生動物纖毛擺動方向［37］及哺乳動物聽覺、觸覺、痛覺的感知［38］等，直到2010 年Coste 等［39］才首次提出Piezo1 和Piezo2 是真正意義上的機械敏感性陽離子通道。自此，Piezo 獨特的結構不僅為我們提供了新的門控機制，同時有助于我們對體內多種生理過程的理解。其中，血壓調節是一種重要的由機械敏感性離子通道介導的機械力轉導過程。我們知道，運動時由于氧耗增加，組織器官需要更多的含氧血流灌注。此時，血管收縮、血壓升高以實現血流分布最佳化，然而血流變化究竟如何引起這種血管反應，目前尚未清楚。Piezo1在血管內皮中表達豐富，Rode 等［40］條件性敲除內皮Piezo1后發現，該通道是調節血流變化與血管收縮中不可或缺的環節。血流改變引起的機械力激活內皮和血管平滑肌細胞上的Piezo1，細胞發生去極化，Ca2+內流，細胞內Ca2+濃度升高從而引起血管收縮。動脈粥樣硬化是腦卒中和心梗的危險因素之一，好發于動脈血流受阻的區域。有趣的是，不同血流狀態可引發內皮細胞Piezo1 不同的級聯反應。例如，層流和湍流均可活化機械敏感型離子通道Piezo1，嘌呤受體P2Y7 和Gq/G11 介導的信號通路。然而，研究表明，只有湍流會導致Piezo1及Gq/G11介導的整聯蛋白活化［41］。繼而，其下游核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活又是調節血管內皮炎癥的關鍵因子，在動脈粥樣硬化等血管疾病中發揮血流特異性調節作用。此外，機械轉導在呼吸系統中同樣起著至關重要的作用，其功能障礙可導致圍產期死亡和成人睡眠呼吸暫停。研究表明，Piezo2表達于氣道感覺神經元，是呼吸相關牽張信號轉導的主要感受器。Nonomura 等［42］觀察到，全基因敲除Piezo2及條件性敲除氣道感覺神經元Piezo2，均可導致小鼠出現呼吸窘迫，甚至死亡。相反，光激活迷走神經元Piezo2 通道則會引起成年小鼠呼吸暫停，提示Piezo2 是介導多種氣道感覺神經元機械轉導的牽張感受器。

2.2 沉默通道（亞基）研究者們通常采用膜片鉗等電生理技術測量流經離子通道的電流，從而進行相關離子通道的研究。然而，并非所有的離子通道孔道形成亞基均具有離子通透功能，因此往往忽略了非導電通道或沉默通道。大多數沉默通道與其經典的離子通道分子伴侶具有高度的結構及序列同源性，且當與大分子復合物相互作用時，可精細調節其結合分子伴侶的生物物理門控特性。電壓門控型鉀離子通道（voltage-gated potassium channels，Kv）是一類受膜電壓調節的鉀通道大家族。功能性Kv 通道由4個具有離子通透能力的α亞基形成孔道，允許鉀離子通過。然而，構成Kv5、Kv6、Kv8和Kv9通道的α亞基不具有離子通透功能，被稱為沉默亞基，其形成的離子通道也無法產生電流［43-44］。KV8.2 通道是一種非導電通道，最近人們發現KV8.2 突變的人類攜帶者視力損傷嚴重，主要涉及KV8.2 與調節視桿、視錐細胞興奮性的KV2.1 通道之間相互作用的改變［45］。

2.3 細胞器陽離子通道 目前，陽離子通道在細胞器中的重要性也得到越來越多地認可。線粒體是細胞的主要代謝與供能場所。長期以來，線粒體K+（mitoK）通道在保護心肌細胞方面發揮重要作用，其中KNa1.2（Slick，Slo2.1）是與心臟保護相關的mitoK通道之一。Smith 等［46］運用單通道膜片鉗技術，在野生型小鼠中發現了6 個與KNa1.2 生物物理特性相似的離子通道，但在KNa1.2基因敲除（knockout，KO）小鼠中卻未有類似發現。他們進一步證明，KNa通道激活劑硫雙二氯酚可使野生型小鼠心肌細胞線粒體呼吸鏈與氧化磷酸化解偶聯，同時KO 小鼠體脂升高，其心臟對能量需求反應能力下降，提示KNa1.2 通道參與調節能量消耗和脂肪代謝。周期性麻痹主要表現為反復發作的骨骼肌弛緩性癱瘓，由電壓門控鈉通道NaV1.4 或電壓門控鈣通道CaV1.1 中電壓感受結構域S4 片段點突變引起。這些突變作用于S4 片段中的精氨酸殘基（R1、R2 或R3），影響其門控作用，從而允許陽離子通過。Jiang 等［47］將細菌NaVAb通道進行相應位點突變，通過X 射線晶體衍射技術解析其高清結構（2.7 ?），不僅觀察到突變導致的陽離子滲漏現象，并確定了可能的藥物結合靶點，將有助于治療低血鉀和正常血鉀型周期性麻痹。

3 結語

近年來，Cryo-EM的發展與應用使人們認識了多種陽離子通道原子級結構，同時也加深了我們對離子通道結構-功能關系的了解。盡管有學者指出Cryo-EM的應用條件不符合實際生理條件，但我們相信，隨著Cryro-EM 的日益成熟，電壓門控、配體門控及其他機械敏感性陽離子通道完整的門控機制終將得以闡明。此外，離子通道功能處于動態變化中，若想全面掌握其門控和離子選擇性機制，還需借助分子動力學模型實現。同時，除了闡明離子通道的結構，基于其結構-功能關系進行的相關藥物研發仍然存在許多未知的難題，這些都需要我們持續不斷地深入研究。