對甲苯磺酰維達列汀抑制巨噬細胞焦亡和促進其凋亡的研究*

聶穎青，熊寶萍，劉海林，劉穎菊

（1重慶醫科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016；2重慶兩江新區第一人民醫院藥劑科，重慶 401121）

炎癥反應參與多種疾病的發生發展，其特征大多伴隨炎癥因子的釋放。在機體炎癥反應發生的同時，抗炎機制會同時啟動以避免過度和持久的炎癥反應造成機體的損傷［1-2］。其抗炎機制包括促進致炎細胞凋亡、釋放抗炎細胞因子，如白細胞介素10（in?terleukin-10，IL-10）等。近年來有研究報道焦亡區別于細胞凋亡，可在不發生核碎裂的情況下誘導炎癥反應，使細胞腫脹，釋放IL-1β 和IL-18等大量炎癥因子［3-4］。這意味著細胞焦亡參與炎癥的發生，但其與細胞凋亡的關系還未闡明。

對甲苯磺酰維達列汀（para-toluenesulfonyl vilda?gliptin，PV）是金剛烷磺酰胺類化合物，分子式為C24H31N3O4S（分子量457.5），結構式見圖1。本課題組已有研究結果顯示，金剛烷磺酰胺類化合物可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激誘導的RAW264.7 巨噬細胞的增殖，并減少由后者產生的炎癥因子［腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1β］的表達，具有顯著的抗炎作用［5-6］，但是，其抗炎作用機制至今未闡明，是否與影響焦亡和凋亡有關，以及其涉及的相關通路有待研究。脂多糖作為革蘭氏陰性細菌細胞壁的一個組成部分不僅能引起巨噬細胞的炎性增殖，也可通過TLR4通路刺激caspase-1 活化，或直接刺激caspase-11 活化引起焦亡的發生。因此，本項工作選用LPS 刺激RAW264.7 巨噬細胞增殖，構建體外焦亡炎癥模型，研究對甲苯磺酰維達列汀對焦亡和凋亡及炎癥因子產生的影響［7］。通過檢測炎癥因子的濃度、焦亡和凋亡及相關蛋白和mRNA 表達，明確對甲苯磺酰維達列汀是否參與影響焦亡與凋亡從而產生抗炎作用。

Figure 1.Chemical structure of para-toluenesulfonyl vildagliptin.圖1 對甲苯磺酰維達列汀的化學結構

材料和方法

1 材料

小鼠巨噬細胞RAW264.7 由重慶醫科大學藥學院生化與分子藥理實驗室提供。對甲苯磺酰維達列汀（含量≥95.1%，由重慶醫科大學藥學院藥化教研室提供）；脂多糖購自Sigma；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自重慶賽米克生物科技有限公司；DMEM 高糖培養液購自Gibco；細胞凋亡檢測試劑盒和超敏顯影液購自碧云天生物技術有限公司；噻唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）、小鼠IL-1β、TNF-α 和IL-6 酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent as?say，ELISA）試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；抗caspase-1抗體、caspase-3 抗體、α-Tublin 抗體和HRP 標記山羊抗兔IgG（H+L）購自武漢三鷹生物技術有限公司；SYBR 購自南京諾唯贊生物科技有限責任公司；逆轉錄試劑盒和引物均購自TaKaRa。

2 方法

2.1 細胞培養及對甲苯磺酰維達列汀及LPS 的配制 RAW264.7 巨噬細胞用含10%的FBS、90%的DMEM 高糖培養液于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，并取對數生長期時的細胞用于實驗。對甲苯磺酰維達列汀（以下用PV 表示），用DMSO 配成可穩定保存的母液濃度為0.2 mol/L 的均勻混懸液，并用含有10%的FBS完全培養液稀釋成不同終濃度的PV溶液用于實驗，并且保證DMSO稀釋倍數大于2 000，排除對細胞本身的影響。LPS 用PBS 配成可穩定保存的濃度為1 g/L 的均勻溶液，并用含有10%的FBS完全培養液稀釋成經濟有效的1 mg/L 的終濃度用于實驗［8］。并選用LPS 刺激RAW264.7 巨噬細胞焦亡炎性增殖模型作為本次的試驗模型。

2.2 MTT 法檢測細胞活力 將細胞按照每孔1×104個接種于96 孔培養板中，并分為對照（control）組、對甲苯磺酰維達列汀陰性對照組（PVNC 組）、LPS 組、LPS+DMSO 組和不同濃度PV+LPS 組，每組設置6 個復孔。藥物處理組分別加入不同濃度PV 預處理24 h，然后除PVNC 組外其余每組再加入等體積的1 mg/L 的LPS 繼續培養4 h。每孔加入20 μL MTT 溶液（5 g/L），避光孵育4 h 后，棄去上清液，每孔加入150 μL的DMSO，避光振搖15 min，酶標儀上于波長490 nm處測各孔吸光度（A）值。重復以上實驗3次。

2.3 流式細胞術檢測細胞的凋亡 將RAW264.7細胞按照每孔1×106個接種于6 孔板中，并分為對照組、LPS 組、LPS+DMSO 組和LPS+PV 組，每組設置3個復孔。PV+LPS 組加入0.3 μmol/L PV（藥物濃度根據MTT實驗結果選擇）預處理24 h后，每組再加入1 mg/L 的LPS 繼續培養4 h，后按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的操作步驟收集細胞，并在30 min內流式上機。重復以上實驗3次。

2.4 ELISA 檢測TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量 將RAW264.7 細胞按照每孔1×106個接種6 孔板中，同2.3的方法分組做相同處理后，收集培養細胞的上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作，以IL-6 為例，加入標準品和待測樣品50 μL，酶標試劑50 μL，37 ℃溫育120 min 后洗板5 次，加底物顯色劑A、B 各50 μL，避光15 min，加終止液50 μL，振蕩10 min，15 min內在波長450 nm處測A值。重復以上實驗3次。

2.5 Western blot檢測細胞中caspase-3和caspase-1蛋白的表達 將RAW264.7 細胞按照每孔1×106個接種于6 孔板中，同2.3 的方法分組做相同處理后，收集細胞提取蛋白并用BCA 蛋白定量檢測蛋白濃度。用SDS-PAGE 分離蛋白，轉移至PVDF 膜上，5%的BCA 封閉液在室溫下封閉2 h，分別孵育caspase-3（1∶1 000）抗體，caspase-1（1∶2 000）抗體，α-Tublin（1∶1 0000）抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，在室溫下孵育相對應的Ⅱ抗50 min，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL進行曝光。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。重復以上實驗3次。

2.6 RT-qPCR 檢測細胞中NLRP3、caspase-1、GSD?MD、IL-1β、IL-18、caspase-11、caspase-3 和Bax 的mRNA 的表達 將RAW264.7 細胞按照每孔1×106個接種于6 孔板中，同2.3 的方法分組做相同處理后，收集細胞，用Trizol 提取出總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書，以RNA 為模板進行反轉錄，得到cD?NA。加入表1中引物，進行擴增。擴增程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s；40 個循環。以β-actin為內參照基因，采用2-ΔΔCt方法，計算mRNA的相對表達量。重復以上實驗3次。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（mean±SD）表示；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；以P＜0.05表示差異有統計學意義。使用GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

結果

1 PV抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞活力

與對照組相比，RAW264.7 細胞受LPS 刺激后，LPS 組和LPS+DMSO 組細胞活力均顯著升高（P＜0.01），證明炎癥模型造模成功。LPS 組與LPS+DMSO 組之間無顯著差異（P＞0.05），證明DMSO 對藥物及細胞無顯著影響。與對照組相比，PV（10 μmol/L）+DMSO 組細胞活力無顯著差異（P＞0.05），證明藥物對細胞無顯著毒性。與LPS+DMSO 組相比，給予PV（3、1、0.3、0.1 和0.03 μmol/L）預處理后，巨噬細胞增殖均受到顯著抑制，且呈劑量依賴性地降低（P＜0.01），見圖2。后續實驗選用有效中間濃度0.3 μmol/L作為給藥濃度。

Figure 2.Effect of para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）on the proliferation of RAW264.7 macrophages induced by LPS.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖2 對甲苯磺酰維達列汀對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞增殖的影響

2 PV促進LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞凋亡

與對照組［（8.3±0.4）%］相比，LPS+DMSO 組細胞凋亡率［（11.1±0.3）%］提高，提示LPS刺激后巨噬細胞增殖活化同時凋亡細胞也增多（P＜0.05）；對甲苯磺酰維達列汀預處理后，0.3 μmol/L 藥物組［（27.3±1.9）%］與LPS+DMSO 組相比促凋亡效應顯著增強（P＜0.01），見圖3。

3 PV抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥因子的產生

LPS+DMSO 組中TNF-α、IL-6 和IL-1β 與對照組中TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達量分別比較均顯著升高（P＜0.01）；0.3 μmol/L PV組以上各炎癥因子表達量與LPS+DMSO 組相比均顯著降低（P＜0.01），見圖4。

4 PV 對LPS 誘導RAW264.7 巨噬細胞caspase-3和caspase-1蛋白表達的影響

與對照組相比，LPS+DMSO 組caspase-1 蛋白表達顯著上調，證明炎癥模型造模成功；0.3 μmol/L PV 可顯著抑制LPS 誘導的巨噬細胞caspase-1 蛋白表達（P＜0.01），并且可顯著上調caspase-3 和cleaved caspase-3 的表達（P＜0.01），見圖5。這表明PV 可促進巨噬細胞凋亡并抑制由LPS誘導的焦亡。

5 PV 對LPS 誘導RAW264.7 巨噬細胞NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、caspase-11、cas?pase-3和Bax的mRNA表達的影響

與對照組比較，LPS+DMSO組中焦亡相關mRNA（NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 和caspase-11）表達均顯著升高（P＜0.05）；0.3 μmol/L PV 組與LPS+DMSO 組比較，以上指標均顯著下調（P＜0.05），且凋亡相關mRNA（caspase-3 和Bax）的表達與LPS+DMSO 組比較均顯著上調（P＜0.01），見圖6。

討論

炎癥反應的發生涉及多條信號通路交互作用，近年來焦亡被發現在其中扮演著重要角色。細胞焦亡也是一種程序性細胞死亡，它不同于凋亡和壞死，是一種炎癥性細胞死亡。細胞焦亡途徑分為經典焦亡途徑和非經典焦亡途徑。經典焦亡途徑的激活是當機體受到外來微生物感染或無菌性的損傷刺激后，可激活細胞的模式識別受體，進而與信號接收器凋亡相關微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和pro-caspase-1 等形成炎癥小體復合物，由此激活焦亡標志蛋白caspase-1。活化的cas?pase-1 使焦亡執行者Gasdermins（如GSDMD）被裂解為Gasdermins-N（GSDMD-N）端，與自抑制的Gasder?mins-C 端，同時剪切pro-IL-1β 和pro-IL-18 生成細胞因子IL-1β 和IL-18，其中GSDMD-N 端插入細胞膜中，在細胞膜定位成孔，導致胞內容物，包括炎癥因子IL-1β 和IL-18外漏到胞外，細胞腫脹，質膜破碎最后細胞溶解，釋放大量炎癥因子，產生細胞焦亡［9-12］；非經典途徑則依賴于caspase-4/caspase-5/caspase-11激活。一些細胞外的細菌刺激物，如革蘭陰性菌特征物內毒素（lipopolysaccharide，LPS），通過外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）內吞作用而到達胞質內，激活caspase-4/caspase-5/caspase-11（小鼠cas?pase-11 的人類對應物caspase-4/caspase-5），caspase-11也可剪切GSDMD 為GSDMD-N端和GSDMD-C端，從而導致細胞焦亡的發生，caspase-11 同時可激活caspase-1，使IL-1β 和IL-18 生成釋放到細胞外［13-14］。細胞焦亡是機體應對外來微生物感染先天免疫的重要組成部分，在炎癥反應放大和繼發損傷中起著重要作用。因此深入探究焦亡與炎癥的關系及其尋找藥物作用的靶點具有研究價值。

Figure 3.Effect of para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）on apoptosis rate of RAW264.7 macrophages induced by LPS.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖3 對甲苯磺酰維達列汀對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞凋亡率的影響

誘導炎癥細胞凋亡是糖皮質激素類藥物的重要抗炎機制。細胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶誘導的程序性死亡。激活的半胱氨酸蛋白酶啟動凋亡后，細胞會發生DNA 片段化、核濃縮、凋亡小體形成、凋亡小體被臨近細胞和巨噬細胞吞噬清除等現象。凋亡過程中細胞質膜完整，無內容物釋放，不直接引起炎癥反應，不影響其他細胞正常功能。在半胱氨酸蛋白酶被激活后，水解級聯反應放大凋亡途徑中cas?pase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10是起始凋亡蛋白酶，caspase-3、caspase-6 和caspase-7 為效應凋亡蛋白酶［15-16］。

Figure 4.Effect of concentration of TNF-α，IL-6 and IL-1β in supernatant of RAW264.7 macrophages induced by LPS after treated with para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）.A：TNF-α；B：IL-6；C：IL-1β.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs con?trol group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖4 對甲苯磺酰維達列汀對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞培養液中TNF-α、IL-6和IL-1β濃度的影響

Figure 5.Protein expression of caspase-1，caspase-3 and cleaved caspase-3 of RAW264.7 macrophages induced by LPS after treated with para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）.A：caspase-1 protein；B：caspase-3 protein；C：cleaved caspase-3 protein.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖5 對甲苯磺酰維達列汀對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞表達caspase-1、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白的影響

Figure 6.Effect of expression of NLRP3，caspase-11，IL-1β，IL-18，caspase-11，GSDMD，caspase-3 and Bax in RAW264.7 mac?rophages induced by LPS after treated with para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）.A：NLRP3 mRNA；B：caspase-1 mRNA；C：GSDMD mRNA；D：IL-1β mRNA；E：IL-18 mRNA；F：caspase-11 mRNA；G：caspase-3 mRNA；H：Bax mRNA.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖6 對甲苯磺酰維達列汀對LPS 誘導RAW264.7 巨噬細胞表達NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、caspase-11、GSDMD、cas?pase-3和Bax mRNA的影響

因此為了解PV 對焦亡和凋亡的影響，本實驗首先建立了LPS 刺激巨噬細胞的炎癥模型。LPS 可被位于質膜上的模式識別受體TLR4識別，從而轉錄激活NF-κB，使NLRP3（Nod-like receptors）轉錄增加，進而與ASC 和pro-caspase-1 形成NLRP3 炎癥小體復合物，從而啟動焦亡。LPS 也通過非經典途徑啟動焦亡。實驗結果顯示，LPS刺激可引起RAW264.7巨噬細胞炎性增殖（圖2）及炎性因子（IL-1β、IL-6 和TNFα）的釋放（圖4），并引起caspase-1 的表達增加（圖5），同時焦亡通路中NLRP3、caspase-1、GSDMD、cas?pase-11、IL-1β 和IL-18 等mRNA 的表達均顯著增高（圖6A、B、C、D、E、F），證實LPS 作用于巨噬細胞，可通過經典和非經典途徑引起巨噬細胞焦亡和炎癥因子釋放，此結果與已有的報道是一致的［17］。也說明細胞炎癥模型建立成功。同時檢測LPS 刺激后凋亡及相關蛋白表達顯示LPS 刺激后RAW264.7 巨噬細胞表達凋亡相關蛋白caspase-3 和Bax 的mRNA 表達顯著降低（圖5B、C、G、H），說明LPS刺激主要引起巨噬細胞焦亡，而不是凋亡。進一步，本實驗檢測了PV 對焦亡和凋亡的影響，實驗結果顯示PV 可抑制LPS 刺激引起的RAW264.7 巨噬細胞的炎性增殖及炎癥因子（IL-1β、IL-6 和TNF-α）的釋放，下調LPS 刺激的caspase-1 的表達以及焦亡通路中NLRP3、cas?pase-1、GSDMD、caspase-11、IL-1β 和IL-18 等mRNA的表達，說明PV 對焦亡激活的經典通路和非經典通路均有抑制作用，可抑制焦亡的發生及炎癥因子的釋放。前期研究中顯示的金剛烷磺酰胺類化合物對TLR4-NF-κB 通路具有抑制作用［6-7］支持此結果。這可能是PV 產生抗炎作用的機制之一。通過流式細胞術檢測藥物對凋亡的影響，結果則顯示PV 可促進LPS 誘導后巨噬細胞的凋亡（圖3），結合其上調凋亡執行蛋白caspase-3 的表達（圖5）、以及caspase-3 和BaxmRNA 的表達（圖6G、H），說明PVB 可促進LPS刺激后巨噬細胞凋亡。綜合以上結果可認為PV 抑制LPS 刺激后巨噬細胞焦亡，促進其凋亡，從而產生抗炎作用。

研究顯示有關焦亡和凋亡的關系較為復雜，至今尚不清楚。有研究報道，凋亡通路啟動后caspase-3 的激活，促進細胞焦亡的發生［18］。而Caspase-1 可激活caspase-7使嗜肺軍團菌感染的巨噬細胞出現早期凋亡［19］，NLRP3 炎癥小體對細胞凋亡和焦亡都有激活作用［20］。化療藥物可通過caspase-3-GSDME 通路誘導腫瘤細胞焦亡的發生［21］。Caspase-3 可剪切DFNA5 為具有成孔活性的DFNA5-N 引起細胞焦亡；高表達DFNA5 的細胞出現細胞焦亡，而低表達DF?NA5 的細胞則出現細胞凋亡［22］。在敲除了GSDMD的單核細胞中，LPS與尼日利亞菌素誘導細胞發生凋亡［23］。研究還發現GSDME-N 促進caspase-3激活，放大內部細胞凋亡的信號通路，并啟動自放大的正前饋回路；GSDMD-N 也顯示促進caspase-3 激活［24］。本實驗結果則顯示LPS 刺激后巨噬細胞出現焦亡，而PV 則能抑制LPS 刺激后巨噬細胞的焦亡，促進其凋亡，并使炎癥因子釋放減少。因此可認為細胞焦亡和凋亡是相互調節轉化的，GSDMD/E 在相互轉化中起著重要作用。當炎癥發生時，炎癥細胞的焦亡促進和放大炎癥反應，而促進炎癥細胞凋亡作為抗炎機制也被啟動，使焦亡被抑制，從而維持機體內環境穩定。由此推測PV 可通過抑制LPS 刺激后巨噬細胞焦亡，從而使GSDMD 表達減少，促進細胞走向凋亡，使炎癥因子產生和釋放減少。但PV 通過什么環節產生以上作用、是通過影響焦亡誘導凋亡還是直接誘導凋亡，其主要的作用靶點是什么尚需要進一步的研究。

綜上所述，PV 作為不同于傳統抗炎藥結構的一種金剛烷磺酰胺類藥物，可抑制巨噬細胞的炎癥增殖及炎癥因子的釋放，具有抗炎作用。抗炎作用機制可能與抑制細胞焦亡和促進炎癥細胞凋亡的發生有關。

（致謝：本研究所涉及的實驗在重慶醫科大學藥學院生物化學與分子藥理學重點實驗室完成，特此致謝！）