華蟾毒它靈通過線粒體途徑引起肝癌細胞凋亡*

潘 越，胡思宏，王佳鑫，李柯金，張亞霖，余詩佳，劉紅亮△，鮑登克△，楊虎山△

（1河南大學藥學院腫瘤標志物與液體活檢實驗室，河南開封 475004；2信陽職業技術學院，河南信陽 464000）

肝癌一種高侵襲性、高致死率、預后差的惡性腫瘤，近年來肝癌的發病率和病死率逐年上升。手術切除是肝癌目前最佳的治療方式，但是肝癌病人往往因為早期癥狀不明顯，不能被及時診斷出來，所以肝癌的早期診斷率很低，大部分患者發現時已經到了晚期，已經失去了手術治療的最佳時機［1］。肝癌的發生進展受很多因素的影響，其發病機制還沒有完全弄清楚。越來越多的研究表明，肝癌的的進展主要由基因突變、原癌基因激活、抑癌基因失活、細胞信號轉導途徑異常活化等多種因素造成［2］。近年來，中藥在腫瘤治療中展現了較好的臨床效果，在提高機體免疫力、減輕放化療副作用，及抑制腫瘤復發和轉移等方面受到了廣泛關注，中藥可顯著提高患者的生存期［3］。華蟾毒它靈是我國傳統動物藥材蟾酥的毒性配基之一，是從蟾蜍科動物如中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺和皮膚的分泌物中提取分離的［4-6］。目前臨床上用于治療肝癌和胃癌等腫瘤的藥物華蟾素注射液的有效成分之一是華蟾毒它靈，它還可用作強心劑、利尿劑和止血劑［7］。華蟾素注射液聯合肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial che?moembolization，TACE）輔助治療晚期肝癌時，可顯著提高TACE 治療效果，減輕TACE 對肝功能的損害程度［8］。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 細胞系 人肝癌細胞系SNU-739 購自南京科佰生物科技有限公司，由本實驗室保存。用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基，選取生長狀態良好，處于對數生長期的細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養，用于實驗。

1.2 實驗動物 本實驗所用的SPF 級雌性BALB/c裸鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（合格證號：No.1100112011000586）。實驗動物的飼養條件符合SPF 級動物室要求，室內溫度21～24℃，空氣相對濕度50%～70%，晝夜節律用日光燈控制，每天光照時間12 h（早7 點～晚7 點）。飲用水為高壓滅菌水，使用飼料為SPF 級動物專用飼料。自由進食、飲水，飼養籠墊料使用SPF 級動物專用墊料，每周更換2次。

1.3 藥品及試劑 華蟾毒它靈（美侖生物公司）；胰蛋白酶、BCA 蛋白定量試劑盒、化學發光法（ECL）顯色試劑盒、結晶紫、多聚甲醛和MTT 試劑（北京索萊寶科技有限公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydroge?nase，LDH)試劑盒、JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒和RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；EdU細胞增殖檢測試劑盒、DAPI 和AnnexinV-FITC 試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；TUNEL 凋亡檢測試劑盒（US Everbright?Inc.）；ATP 試劑盒（Pro?mega）；抗Bax 和Bcl-2 抗體（Proteintech）；抗NF-κB p65和NF-κB p-p65抗體（Cell Signaling Technology）；RPMI-1640 培養基（Corning）；新生胎牛血清（Biologi?cal Industries）；磷酸酶和蛋白酶抑制劑（Roche）；蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific-CN）；RNA 提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；引物由上海Sangon生物制品公司合成。

2 實驗方法

2.1 培養細胞的觀察和MTT 法檢測細胞活力 對數生長的SNU-739 細胞以1×108/L 接種于96 孔板中，每孔100 μL，待細胞生長到80%左右狀態時進行實驗。每孔加入100 μL 不同濃度的華蟾毒它靈（50、100、200、300、400、500 和1 000 nmol/L），另外設置空白對照組，在培養箱中培養48 h 后加入10 μL MTT（5×10-3mg/L），繼續培養4 h 后加入110 μL DMSO，在搖床上振蕩至充分溶解，再在酶標儀490 nm 波長處測各孔的A值，實驗重復3次。按照以下公式計算細胞活力抑制率，細胞活力抑制率（%）=［1-（實驗組A）/（對照組A）］×100%，半數抑制濃度（inhibitory con?centration 50，IC50）值由軟件求出。同時，在倒置顯微鏡下觀察華蟾毒它靈作用48 h 后的肝癌細胞形態變化。

2.2 LDH 細胞毒性檢測法檢測華蟾毒它靈的細胞毒性 對數生長的SNU-739 細胞以1×108/L 接種于96孔板中，每孔100 μL，在培養箱中37℃培養24 h待細胞貼壁后，每孔加入不同濃度的華蟾毒它靈（0、150、300 和600 nmol/L），另外設置空白對照組，37℃培養箱繼續培養48 h后，用移液槍取上清液60 μL到新的孔中，加入已經配置好的30 μL 的LDH 檢測工作液，混勻，在室溫下避光孵育30 min，490 nm 處測定A值。

2.3 集落形成實驗檢測SNU-739 細胞的增殖 對數生長的SNU-739 細胞以5×108/L 接種于6 孔板中，每孔2 mL，在37℃培養箱中培養24 h待細胞貼壁后，每孔加入不同濃度（0、150、300 和600 nmol/L）的華蟾毒它靈，另外設置空白對照組，每隔4 d 換1 次培養基，當鏡下能觀察到約40 個集落時停止培養。然后用PBS清洗3次，多聚甲醛固定40 min后再用結晶紫染色30 min，拍照計數，實驗重復3次。

2.4 EdU 細胞增殖實驗檢測SNU-739 細胞增殖 對數生長的SNU-739 細胞以1×108/L 接種于96 孔板中，每孔100 μL，在37℃培養箱中培養24 h待細胞貼壁后，每孔加入不同濃度的（0、150、300 和600 nmol/L）華蟾毒它靈，另外設置空白對照組，繼續在37℃培養箱中培養48 h，終止培養。根據EDU 細胞增殖檢測試劑盒說明書進行細胞固定化、EDU 反應、染色等步驟。再在熒光顯微鏡下進行觀察拍照。

2.5 DAPI 染色觀察SNU-739 細胞凋亡的形態學變化 將藥物處理后的SNU-739 細胞，在37℃培養箱中繼續培養48 h 后終止培養，用PBS 清洗3 次，然后用4%多聚甲醛固定5 min，稀釋DAPI 染液使其終濃度為50 μmol/L，每孔100 μL，室溫避光染色20 min，在PBS洗滌后于熒光顯微鏡下觀察細胞形態變化。

2.6 TUNEL 染色檢測細胞凋亡 將對數生長期的SNU-739 細胞以1×108/L 接種于96 孔板中，每孔100 μL，在37℃培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，每孔加入不同濃度的華蟾毒它靈（0、150、300和600 nmol/L）。另設空白組，37℃繼續培養48 h 后終止培養，用4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS 清洗2 次，加入100 μL TUNEL 平衡緩沖液，常溫孵育5 min 后，最后加入50 μL 反應緩沖液，避光孵育60 min，用離心機離心棄掉上清液，加入5×10-3mg/L BSA 清洗，熒光顯微鏡下觀察細胞的形態變化并拍照。

2.7 流式細胞術檢測SNU-739 細胞的凋亡率 收集對數生長期細胞并調整細胞至3×108/L接種于6孔板中，每孔2 mL 細胞液，待細胞貼壁，各組細胞分別加入不同濃度的（0，150，300 和600 nmol/L）華蟾毒它靈并在37℃培養箱中培養48 h 后收集細胞，采用Annexin V/PI 染色后1 h 內每組收集固定10 000 個細胞進入流式細胞儀檢測肝癌細胞凋亡率。每組樣品重復做3次。

2.8 RT-qPCR 檢測肝癌細胞凋亡相關因子Bcl-2和Bax 的mRNA 水平 肝癌細胞SNU-739 經藥物處理后，用Trizol 法提取總RNA，然后用Prime Script RT-PCR 試劑盒反轉錄生成cDNA。Bax 的上游引物序列為5'-TGGCAGCTGACATGTTTTCTGAC-3'，下游引物序列為5'-TCACCCAACCACCCTGGTCTT-3'；Bcl-2 的上游引物為5'-GTGGATGACTGAGTACCT?GAACC-3'，下游引物序列為5'-AGACAGCCAG?GAGAAATCAAAC-3'；GAPDH 的上游引物為5'-CC?GTGACAATTACCTGGCCTTC-3'，下游引物序列為5'-CAGGGCCTTCAGCTGGTTTC-3'。20 μL 反應體系組成：SYBR FAST qPCR Mix（2×）10 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、cD?NA 模版2 μL、ddH2O 6 μL。反應條件為：95℃5 min；95℃15 s，60℃1 min，40 個循環。最后運用2-ΔΔCt法分析各基因的相對表達情況［9］。

2.9 Western blot 法檢測細胞凋亡相關分子的蛋白水平 收集對數生長期細胞并調整細胞至3×108/L接種于6 孔板中，每孔2 mL 細胞液。細胞經藥物處理48 h后，用含有1 mmol/L PMSF 的RIPA 裂解液，裂解細胞收集細胞總蛋白，用BCA 測定試劑盒測定各組蛋白濃度。經SDS-PAGE、轉膜、封閉、4℃過夜孵育Ⅰ抗后，再用TBST 洗膜10 min、3 次，室溫孵育HRP標記的羊抗兔IgGⅡ抗（1∶5 000）1 h，TBST洗膜10 min、3 次，采用ECL 化學發光法進行顯影并觀察拍照。

2.10 JC-1 熒光探針檢測線粒體膜電位 細胞經華蟾毒它靈作用48 h 后棄去培養基，PBS 洗滌2 次，每孔加入1 mL JC-1 染色工作液，37℃孵育20 min，PBS洗滌2次后，熒光顯微鏡下觀察。

2.11 ATP 生成的檢測 細胞經華蟾毒它靈作用48 h 后棄去培養基，加入CellTiter-Glo 試劑，室溫孵育10 min，使用酶標儀檢測熒光信號。

2.12 裸鼠皮下成瘤實驗檢測華蟾毒它靈對SNU-739 細胞體內增殖的抑制作用 將4 周齡雌性BALB/c裸鼠，隨機分成DMSO對照組和給藥組，每組5 只。每只裸鼠右側肩胛骨皮下接種6×106個SNU-739 細胞，接種1 周后，使用游標卡尺測量腫瘤的最長徑和最短徑，待小鼠瘤體直徑長至2～3 mm 時，向腫瘤內注射華蟾毒它靈（對照組注射DMSO）2 mg/kg，每周2 次。注射4 周后使用脫臼法處死小鼠，取出腫瘤塊，稱重，拍照，繪制成瘤生長曲線。

2.13 免疫組化法檢測腫瘤組織ki67 的表達用商品化免疫組織化學試劑盒，按照步驟進行石蠟組織切片脫蠟，水化，抗原修復，封閉，Ⅰ抗孵育、Ⅱ抗孵育，DAB 顯色、蘇木精復染等操作流程檢測ki67表達情況。每次均設有陽性對照及陰性對照。每個染色樣品選5 個不同高倍視野，每個視野計數100 個細胞，采用雙盲法進行閱片，對蛋白染色強度和陽性細胞百分比進行評分，綜合二者評分分析檢測ki67 在肝癌組織中的表達水平。

3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，數據以均數標±標準誤（mean±SEM）表示，均數間比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1 華蟾毒它靈抑制SNU-739細胞的增殖能力

MTT 實驗結果表明，華蟾毒它靈能顯著抑制肝癌SNU-739 細胞的活力，并有明顯的藥物劑量依賴性，IC50為300 nmol/L（圖1A）。同時LDH 檢測結果也顯示，藥物作用濃度與細胞釋放的LDH 含量呈正比（圖1B）。顯微鏡觀察發現，正常組細胞貼壁生長，形態規則，華蟾毒它靈給藥組均看到不同程度的細胞死亡（圖1C）。我們通過集落形成實驗和EdU 實驗研究了華蟾毒它靈對肝癌細胞增殖的影響，結果如圖1D 所示，華蟾毒它靈能夠明顯抑制SNU-739 細胞的集落形成，并具有一定的劑量依賴性；EdU 實驗表明，華蟾毒它靈作用后SNU-739 細胞的染料摻入百分比明顯低于對照組，隨著藥物濃度的增加，EdU染料摻入細胞的百分比越低（圖1E）。上述結果表明，華蟾毒它靈能夠明顯抑制SNU-739 細胞的體外增殖能力。

2 華蟾毒它靈誘導肝癌SNU-739細胞凋亡

DAPI 染色結果表明，華蟾毒它靈作用后，SNU-739 細胞的細胞核表現為濃縮、碎裂、染色加深的大小不等的圓形小體，核膜聚集于一邊（圖2A）。TU?NEL 染色結果發現，隨著華蟾毒它靈藥物濃度的增大，綠色熒光陽性細胞比例逐漸越多，表明細胞凋亡比例逐漸增加（圖2B）。流式細胞術檢測結果也表明，華蟾毒它靈作用后可顯著促進SNU-739 細胞的凋亡（圖2C）。

3 華蟾毒它靈通過線粒體相關途徑誘導肝癌SNU-739細胞凋亡

為了進一步研究華蟾毒它靈誘導肝癌細胞凋亡的機制，我們首先使用JC-1 熒光探針檢測華蟾毒它靈對肝癌細胞線粒體膜電位的影響。結果顯示，華蟾毒它靈作用后不僅細胞密度下降明顯，而且較多的細胞被染上綠色熒光，表明細胞的線粒體膜電位下降（圖3A）。同時，ATP 檢測發現華蟾毒它靈作用后，SNU-739細胞的ATP 生成也顯著減少（圖3B），表明，華蟾毒它靈作用后，SNU-739 的線粒體功能明顯受到影響。最后，我們檢測了華蟾毒它靈對肝癌細胞中線粒體凋亡途徑中關鍵分子Bax和Bcl-2表達水平的影響，以及對NF-κB 信號途徑活化情況的影響。Western blot 和RT-qPCR 結果發現，華蟾毒它靈作用后促凋亡相關分子Bax 的表達水平顯著升高，而凋亡抑制相關分子Bcl-2 的表達水平下降（圖3C）。同時，華蟾毒它靈作用后p65 磷酸化水平顯著減少，而p65 的總體水平并無顯著變化（圖3D）。以上結果表明，華蟾毒它靈可能通過抑制線粒體途徑誘導肝癌細胞凋亡。

4 華蟾毒它靈抑制肝癌SNU-739體內增殖

為了進一步研究華蟾毒它靈對肝癌細胞體內增殖的抑制效果，我們研究了其對SNU-739 細胞裸鼠皮下成瘤的影響。如圖4 所示，與對照組相比，華蟾毒它靈給藥后的腫瘤體積和重量均明顯下降。同時，華蟾毒它靈給藥后核增殖抗原Ki-67的表達也顯著降低。以上結果表明，華蟾毒它靈可以抑制肝癌細胞SNU-739細胞的體內成瘤及增殖。

討論

肝癌是一種高侵襲性、高致死率、預后差的惡性腫瘤，近年來肝癌的發病率和病死率逐年上升，手術切除是肝癌目前最佳的治療方式［1］。近年來，中藥在腫瘤治療中的潛能受到了廣泛的關注，展現出一定的臨床優勢，主要表現在提高患者術后免疫力、減輕患者放化療副作用、腫瘤復發抑制和減少轉移等方面。比如，冬凌草甲素可通過誘導細胞凋亡，阻滯細胞在G2/M期，抑制食管癌細胞的增殖，并通過抑制上皮-間質轉化標志蛋白的表達從而抑制食管癌細胞的遷移。一些中藥可顯著抑制癌細胞增殖和轉移，如復方苦參注射液可以有效的抑制結腸癌、腦癌和乳腺癌的轉移［10］，中藥人參皂苷可以抑制胃癌細胞的轉移［11］。雷公藤甲素可以顯著抑制宮頸癌HeLa 細胞體外增殖，其機制與細胞周期阻滯于S 期和影響細胞周期因子cyclin B1 的表達和改變P34 磷酸化有關。前期研究表明，細胞凋亡與線粒體功能密切相關，凋亡細胞的線粒體膜電位下降，ATP 生成減少［12-13］。

Figure 1.Cinobufotalin inhibited the proliferation of SNU-739 cells.A：MTT assay was performed to assess the viability in SNU-739 cells treated with different concentrations of cinobufotalin for 48 h；B：the effects of cinobufotalin at different concentrations on the release of LDH from SNU-739 cells were detected by LDH assay；C：cell morphology were observed in SNU-739 cells treated with different concentrations of cinobufotalin for 48 h（scale bar=10 μm）；D：colony-forming ability of SNU-739 cells was detected after incubated with different concentrations of cinobufotalin（scale bar=10 mm）；E：EdU adultera?tion method was used to detect the proliferation capacity of SNU-739 cells after 48 h action of cinobufotalin at different con?centrations（scale bar=10 μm）.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs 0 nmol/L group.圖1 華蟾毒它靈抑制SNU-739細胞活力和增殖能力

Figure 2.Cinobufotalin induced apoptosis of SNU-739 cells.After treatment with different concentrations of cinobufotalin for 48 h，the apoptosis of SNU-739 cells was detected by DAPI staining（A），TUNEL staining（B）and flow cytometry with Annexin V/PI staining（C）.The scale bar=10 μm.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 nmol/L group.圖2 華蟾毒它靈誘導肝癌SNU-739細胞凋亡

然而，華蟾毒它靈雖可通過抑制肝癌細胞增殖用于肝癌治療，但其具體作用機制尚不清楚。本實驗通過體內外檢測方法充分證明華蟾毒它靈可顯著抑制肝癌細胞SNU-739 的增殖。MTT 實驗發現，華蟾毒它靈藥物濃度越高，對SNU-739 細胞生長的抑制效果越強；LDH 檢測結果也顯示，華蟾毒它靈作用濃度與SNU-739 細胞釋放的LDH 含量呈正比；集落形成實驗和EdU 實驗都進一步證實了華蟾毒它靈可顯著抑制肝癌細胞SNU-739 的增殖。同時，我們還在裸鼠皮下移植瘤模型中證明了華蟾毒它靈也可在體內抑制肝癌細胞的增殖和腫瘤的進展。有大量研究表明，藥物誘導的細胞凋亡在抗腫瘤研究中扮演著重要的角色［14］。抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax同屬于Bcl-2基因家族，與腫瘤細胞凋亡密切相關。細胞發生凋亡時促凋亡基因Bax與抑凋亡基因Bcl-2的比值增大［15］。有研究表明，華蟾毒它靈通過上調Bid、Bax、cytochrome-C、caspase-2/-3/-8/-9 及Fas受體的表達，誘導內源性和外源性凋亡通路。華蟾毒它靈是否也可通過促進肝癌細胞凋亡來發揮其抗腫瘤效果尚不清楚。本實驗中流式細胞術、TUNEL和DAPI 染色結果都證明華蟾毒它靈可誘導SNU-739 細胞凋亡。同時，華蟾毒它靈處理組Bax 的mRNA 和蛋白表達均上調，而Bcl-2 的表達下調。前期有研究表明，Bcl-2 家族蛋白是線粒體膜上調控細胞凋亡的一類蛋白，該蛋白的結合狀態將調節線粒體膜電位的變化，同時伴隨著ATP 的變化［13］。Li等［16］發現中藥花椒的提取物可破壞腫瘤細胞的線粒體膜電位，誘導線粒體途徑的細胞凋亡、抑制腫瘤增殖，從而發揮抗腫瘤活性。我們的研究結果也證實了華蟾毒它靈處理組細胞的線粒體膜電位下降，呈濃度依賴性，同時華蟾毒它靈作用下ATP 生成量也減少。本實驗也發現了華蟾毒它靈對細胞p-p65 有濃度依賴性的下調，對總p65 水平沒有影響，這說明華蟾毒它靈可能通過NF-κB 通路誘導細胞凋亡從而抑制肝癌SNU-739 細胞的增殖，為我們后續實驗提供了明確的思路。

Figure 3.Apoptosis induced by cinobufotalin was related to mitochondrial function.A：mitochondrial membrane potential were inves?tigated in SNU-739 cells using the JC-1 probe（indicated by ratio of red to green fluorescence）；B：ATP synthesis level in SNU-739 cells；C：RT-qPCR analyses were performed to detect the mRNA expression changes of Bax and Bcl-2 in SNU-739 cells after treated with different concentrations of cinobufotalin for 48 h；D：Western blot analysis was performed to de?tect the protein expression changes of Bax，Bcl-2，p65 and p-p65（Ser536）in SNU-739 cells after treated with different concentrations of cinobufotalin for 48 h.The scale bar=10 μm.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 nmol/L group.圖3 華蟾毒它靈誘導肝癌細胞凋亡與線粒體功能相關

Figure 4.Cinobufotalin inhibited proliferation of SNU-739 cells in vivo.A：mice were sacrificed 4 weeks after the indicated treat?ments，and the tumor weight and tumor volume were measured；B：immunohistochemical staining for Ki67 in the tumors of each group and the percentage of Ki-67 positive cells（scale bar=10 μm）.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group.圖4 華蟾毒它靈抑制體內肝癌SNU-739細胞移植瘤增殖

綜上所述，本研究表明，華蟾毒它靈可以在體內外抑制肝癌細胞株SNU-739 細胞的增殖，下調Bcl-2蛋白的表達，上調Bax 的表達，下調NF-κB p65 的磷酸化水平，使線粒體膜電位下降、ATP 生成減少，從而促進肝癌細胞的凋亡。華蟾毒它靈對肝癌細胞具有良好的抗腫瘤作用，進一步研究其在肝癌等惡性腫瘤中的作用及分子機制，將為華蟾毒它靈在臨床腫瘤治療的應用上提供更加可靠的依據。華蟾毒它靈誘發肝癌細胞線粒體途徑的凋亡，其具體機制還有待于進一步研究證實。通過哪些信號通路發揮作用？如何影響線粒體的功能？均有待進一步探討。