慢性應激大鼠齒狀回的興奮性氨基酸在空間學習中的變化*

孫傳博，于曉雪，金清華，李英順

（延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室，吉林延吉 133002）

隨著生活節奏的加快和社會競爭的加劇，生活和工作的各種壓力導致人們普遍處于慢性應激（chronic stress，CS）狀態，CS 已成為威脅健康的重要因素［1-2］。CS 可引起下丘腦-垂體-腎上腺皮質（hy?pothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸的激活而產生大量糖皮質激素（在嚙齒類動物中主要是皮質酮）［3］。海馬是學習和記憶功能的關鍵部位，存在著豐富的糖皮質激素受體，因此，CS可通過改變海馬的結構和功能來影響學習和記憶［4-6］，但其具體的神經化學機制尚不完全清楚。

谷氨酸（glutamate，Glu）和天冬氨酸（aspartate，Asp）是中樞神經系統內公認的興奮性氨基酸類（ex?citatory amino acids，EAAs）神經遞質，且均可通過谷氨酸能NMDA 受體發揮作用［7］。哺乳類動物海馬的幾個亞區在學習和記憶過程中表現出不同的功能，其中，海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）作為海馬與外界聯系的關鍵部位，對編碼空間信息非常重要［8］。突觸傳遞效應的長時程增強（long-term potentiation，LTP）是海馬學習記憶功能的重要電生理學基礎。研究表明，CS 顯著影響海馬DG 區的LTP［9］。文獻報道，海馬DG 區LTP 的產生和維持是NMDA 受體依賴性的［10］，且本實驗室先前的研究證明，大鼠海馬DG區的Glu 和Asp 可通過調節LTP 參與主動回避學習［11-12］，但對海馬DG 區的Glu 和Asp 是否通過上述機制參與調節CS 大鼠的空間學習記憶功能尚未見報道。因此，本實驗通過Morris 水迷宮（Morris water maze，MWM）實驗觀察大鼠空間學習記憶能力的改變，并利用腦部微量透析和在體生物電記錄的方法對海馬DG 區的EAAs 含量及場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）幅值在空間學習記憶過程中的變化進行動態測定，以探討CS 影響海馬空間學習記憶功能的部分神經化學機制。

材料和方法

1 動物

實驗選用20個月齡的清潔級雄性SD大鼠，體重在600～650 g 之間，由延邊大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（吉）2017-0003，正常飼養。

2 試劑與儀器

2.1 實驗試劑 皮質酮（corticosterone，CORT）ELISA 試劑盒購于中國武漢華美公司；Glu 和Asp 購于北京邦定泰克生物技術有限公司；鄰苯二甲醛購于Sigma；水合氯醛購于BBI生命科學有限公司。

2.2 實驗儀器 MWM 購于上海吉量軟件科技有限公司；腦立體定位儀（S-R 型）購于成茂公司；微量灌注泵（ESP-64）、生物活性物質微量分析系統（HTEC-500）、樣本自動收集器（EFC-82）購于Eicom；刺激隔離器（A.M.P.I.）購于ISO-Flex；交流放大器（AC.Digitimer）購于Neurolog；信號轉化器（Micro3）購于CED。

3 方法

3.1 動物分組與模型制備 16 只大鼠隨機分為對照（control）組和CS 組，每組8 只。參考相關文獻［12］，按照隨機數字表每天給予CS 組大鼠1 種應激刺激（夾尾，1 min；禁食水，24 h；束縛，4 h；傾斜鼠籠，24 h；通宵照明，12 h；濕墊料，24 h；冰水游泳，5 min；水平旋轉，15 min），共持續30 d，期間對照組大鼠不做處理，正常飲食、水。

3.2 手術過程 30 d的CS模型大鼠制備結束后，將大鼠以10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉并固定于腦立體定位儀上，剃毛消毒后切開透皮充分暴露前后囟。以前囟為參考點，將微量透析外套管（外面黏附著記錄電極用鋼管）植入到海馬DG 區上方1.5 mm 處（定位坐標為：前囟后3.4 mm，中線右側1.6 mm，深3 mm），并通過鋼管將記錄電極插入到DG 區，同時將刺激電極植入到與記錄電極同側的穿通纖維（perfor?natpath，PP）處（坐標為：前囟后7 mm，中線右側5 mm，深4.5 mm）固定，參考電極通過螺絲固定于顱骨表面。術后每只大鼠單獨飼養并恢復2 d，然后在清醒狀態下經外套管向海馬DG 區插入自制的微量透析探針并用蠟固定好，接著開始進行下一步的行為學、微量透析實驗和電生理記錄。

3.3 MWM 實驗 MWM 實驗共分為兩個階段，即定位航行實驗和空間探索實驗，分別評價大鼠的空間學習和記憶能力。在前4 d的定位航行實驗中，大鼠依次由各象限入水點入水游泳，在120 s 內尋找水面下隱藏的站臺，觀測大鼠的逃避潛伏期和游泳速度。在第5天的空間探索實驗中，撤去站臺，在120 s內觀察大鼠的各象限路程百分比以及游泳速度。

3.4 海馬DG 區EAAs 含量和fEPSP 幅值的測定MWM 訓練開始前和每天訓練結束后進行海馬DG區微量透析和fEPSP 幅值的測定實驗。將微量透析探針與微量灌注泵連接，以1.5 μL/min 的速度灌流改良林格氏液（2.3 mmol/L CaCl2，4.0 mmol/L KCl，147.0 mmol/L NaCl），穩定后開始收集透析樣本，每管收集10 min，共收集3個管。取透析樣本12 μL，加入3 μL的鄰苯二甲醛溶液，反應2.5 min，抽取10 μL反應液注入到生物活性物質微量分析系統，通過高效液相色譜和電化學檢測的方法分析出Asp 和Glu的含量。刺激電極連接刺激隔離器，使方波脈沖（刺激強度為引起最大fEPSP 效應的1/2）作用于PP，誘發出的DG 區fEPSP 反應經記錄電極傳到交流放大器進行放大（×1 000）和過濾（0.5～2.0 kHz），并通過信號轉化器轉化成數字信號，應用Spick 2 軟件對fEPSP的幅值（LTP的指標）進行分析，連續記錄15個波痕，統計幅值的平均值。

3.5 大鼠血清中CORT 含量的測定 所有實驗結束后，將大鼠過量麻醉處死，心臟采血，收集血清，用ELISA 試劑盒測定大鼠血清中CORT 的含量，實驗流程按照說明書進行。

4 統計學處理

采用Prism 5.0 進行數據的統計分析。數據均以均數±標準差（mean±SD）表示，用單因素方差分析和t檢驗分析數據，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 慢性應激對大鼠體重和血清CORT水平的影響

CS模型制備開始前，對照組和CS組大鼠的體重無顯著差異（P＞0.05）。CS模型制備成功后，CS組大鼠體重明顯低于應激前，與對照組相比有顯著差異（P＜0.05）；比較兩組大鼠血清中CORT水平，CS組顯著高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 慢性應激對大鼠體重和血清CORT水平的影響Table 1.The effects of chronic stress（CS）on body weight and serum corticosterone（CORT）level in the rats（Mean±SD. n=8）

2 慢性應激對大鼠空間學習和記憶能力的影響

在4 d 的MWM 定位航行實驗過程中，對照組和CS組大鼠找到隱藏站臺的逃避潛伏期均隨著實驗天數增加而減少，但是CS 組大鼠每天的逃避潛伏期均顯著長于對照組（P＜0.05），見圖1A。MWM 實驗的第5 天，撤去水中的站臺進行空間探索實驗，結果顯示，兩組大鼠都顯示出對目標象限（第Ⅰ象限）的顯著偏好（P＜0.05），但是與對照組比較，CS 組大鼠在目標象限游泳路程百分比顯著減少（P＜0.05），見圖1B。表2顯示，兩組大鼠在MWM 實驗中每天的游泳速度并無顯著差異（P＞0.05）。

Figure 1.Effects of chronic stress（CS）on spatial learning and memory of the rats.A：the escape latency in the place navigation trial of MWM test；B：the proportion of total swimming distance in each quadrant in the spatial probe trial of the MWM test.“T”indicates target quadrant.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs 1 d；#P＜0.05 vs control group；@P＜0.05 vs quadrant 1.圖1 慢性應激對大鼠空間學習和記憶的影響

表2 慢性應激對MWM實驗中的大鼠游泳速度的影響Table 2.The effects of chronic stress（CS）on swimming speed of rats in MWM test（mm/s.Mean±SD. n=8）

3 海馬DG區fEPSP幅值在MWM實驗中的變化

本實驗以fEPSP 幅值的增加作為判定LTP 形成的標準，并將訓練前的平均幅值設定為100%。由圖2可知，對照組大鼠DG區fEPSP的幅值在MWM 實驗過程中表現出先增加后降低的趨勢，在實驗第3 天和第4 天顯著大于訓練前水平（P＜0.05）；與之相比，CS 組大鼠DG 區fEPSP 的幅值在MWM 實驗過程中未出現顯著性變化，實驗第3 天的fEPSP 的幅值與對照組相比顯著降低（P＜0.05）。

4 海馬DG 區Glu 和Asp 水平在MWM 實驗中的變化

如圖3 所示：對照組大鼠海馬DG 區Glu 水平表現出先升高后下降的趨勢，在實驗的第3天和第4天顯著高于訓練前的基礎水平（P＜0.05），相比之下，CS 組大鼠DG 區Glu 水平在整個過程中不僅無顯著變化，還在MWM 實驗第2～4 天，其含量較對照組顯著降低（P＜0.05）；兩組海馬DG 區的Asp 水平也表現出與Glu 相同的趨勢，即，在實驗的第2～4 天，對照組Asp 水平顯著高于訓練前的基礎水平（P＜0.05），而CS 組大鼠DG 區Asp 水平在MWM 實驗過程中未出現顯著變化，而在實驗第3天，DG 區Asp 水平較對照組顯著降低（P＜0.05）。

Figure 2.Effects of chronic stress（CS）on fEPSP amplitude in hippocampal DG of rats.The fEPSP amplitude in the DG during MWM test is expressed as percentage of the value obtained before starting behavioral training（0 d）.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs 0 d；#P＜0.05 vs control group.圖2 慢性應激對大鼠海馬DG區fEPSP幅值的影響

Figure 3.Effects of chronic stress（CS）on the levels of excitatory amino acids in hippocampal DG of rats.A：the levels of glutamate（Glu）in the DG；B：the levels of aspartate（Asp）in the DG.The Glu and Asp levels in the DG during the MWM test are expressed as percentages of the values obtained before starting behavioral training（0 d）.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs 0 d；#P＜0.05 vs control group.圖3 慢性應激對大鼠海馬DG區興奮性氨基酸水平的影響

討論

CS 普遍存在于日常生活中［1-2］，其對學習和記憶的影響因年齡而異，但CS 誘導的空間記憶障礙主要在年輕或成年大鼠中被證實，而對老年大鼠研究較少［13-14］，因此本實驗選擇20 月齡的老齡大鼠為研究對象。另外，本實驗中采用8 種較溫和的日常應激源，每天隨機給予一種，共30 d，文獻報道，此種應激模式包括不可預測的各種困擾而非創傷性事件，更利于模擬日常生活的CS狀態［15］。研究表明，CS可激活HPA 軸而導致血清糖皮質激素明顯增加［3］，并顯著降低大鼠的體重和攝食量［2］。本實驗結果顯示，CS 組大鼠的體重顯著降低，且血清中CORT 水平顯著高于對照組，提示CS模型制備成功。CS對學習和記憶功能的影響較為復雜，可因應激原特性和受應激刺激機體的狀態不同而出現促進或抑制的多樣影響［16］。在本實驗中，CS 組大鼠的逃避潛伏期顯著延長，在目標象限游泳的路程顯著減少，但其游泳速度無顯著變化，提示慢性不可預測性應激可損害老齡大鼠的空間學習記憶能力，而這與大鼠的運動能力無關。海馬DG 區是新信息進入海馬的主要部位，作為成年哺乳動物腦內神經發生的關鍵部位，它在空間信息的編碼和處理中起著重要作用［17］，且有證據表明DG 區對應激非常敏感［14］。研究表明，應激可通過影響海馬DG 區的神經發生［18］和神經炎癥［19］等來改變大鼠的學習記憶功能，因此，我們推測海馬DG區可能參與本實驗中CS誘導的大鼠空間認知損傷。

目前普遍認為，LTP 是海馬參與包括空間記憶在內的多個學習和記憶過程的重要機制，且多數研究利用fEPSP 的增加表示LTP 的產生［20-21］。研究表明，海馬DG 區的LTP 可由新的空間學習過程所觸發［21-22］，而CS 對其有顯著影響［9，14］。與之相符，本實驗結果也顯示，在空間學習過程中，海馬DG 區的fEPSP 幅值在對照組大鼠顯著增加，而在CS 大鼠未出現顯著變化，提示CS 損傷大鼠的空間學習和記憶能力，可能與抑制空間學習過程中的海馬DG 區LTP的形成有關。

目前公認的海馬DG 區LTP 的產生機制是：刺激引起突觸前神經元的興奮、末梢釋放Glu，激活突觸后膜的NMDA受體、引起突觸后膜內Ca2+濃度明顯增加，觸發與Ca2+相關的一系列生理生化反應，包括AMPA 受體亞基在突觸后膜上的表達增加等，進而增強突觸傳遞效應，而且LTP 的維持需要突觸前末梢神經遞質釋放的增加［23-24］。Asp 和Glu 是中樞神經系統中兩種重要的EAAs類神經遞質，均可作用于谷氨酸能的NMDA 受體，在興奮性突觸傳遞中起著重要作用［24-25］。在海馬神經元，Asp 和Glu 存在于相同的神經末梢中，通過不同轉運體運到同一個囊泡，并在神經元興奮時以Ca2+依賴性胞吐方式釋放到突觸間隙［25］。先前的研究證實，海馬DG 區的Glu 和Asp參與主動回避學習及相關LTP的形成中［11-12］，但它們是否也參與CS 誘發的空間認知損傷尚未見報道。本實驗結果顯示，在空間學習過程中，海馬DG 區的Glu 和Asp 水平在對照組顯著增加而在CS 大鼠未出現顯著變化，且這些變化與同區域的fEPSP 幅值的變化趨勢相似。研究表明，應激或高濃度糖皮質激素可導致海馬神經元EAAs 轉運體蛋白表達及神經膠質細胞攝取EAAs的異常［26］。這些結果提示，大鼠海馬DG 區的Glu 和Asp 可能參與空間學習相關LTP的形成，而CS 則通過抑制空間學習過程中的DG 區EAAs 的增加阻礙LTP 的形成，進而損害大鼠的空間學習記憶功能。