α4亞基Arg-188和Pro-198突變促進α4β2煙堿型乙酰膽堿受體開放*

俞柳彤，王柳珺，長孫東亭，吳 勇，羅素蘭，

（1海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室，海口市海洋藥物重點實驗室，海南大學生命科學與藥學院，海南海口 570228；2廣西大學醫(yī)學院，廣西南寧 530004）

煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine re?ceptors，nAChRs）是一類廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的配體門控離子通道，具有重要生理活性［1］。在動物體內(nèi)，人們已發(fā)現(xiàn)nAChRs 含有17 種亞基，分別命名為α（1～10）、β（1～4）、γ、δ 和ε，它們以同源或異源五聚體形式組成不同類型nAChRs。在人體內(nèi)，內(nèi)源性配體乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）與nAChRs的N 端胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激發(fā)通道打開，選擇性透過陽離子，從而發(fā)揮生理功能［2］。α7 和α4β2 nAChRs是哺乳動物大腦中含量最豐富的兩種nAChRs，其中α4β2 nAChR 主要分布在大腦腹側(cè)被蓋區(qū)、紋狀體、皮質(zhì)和小腦等組織中［3］，在尼古丁成癮、認知退行性神經(jīng)疾病和病理性疼痛中起著重要作用［4］，是戒煙和抗成癮藥物的主要作用靶點［5］。

煙草依賴難以戒斷，危害人類健康。尼古丁（nicotine）是煙草中的重要活性成分，主要作用靶點為α4β2 nAChRs，具有強烈的成癮性［6-8］。在尼古丁替代療法中，使用低劑量尼古丁輔助戒煙成功率低，治療周期長，仍具有一定的成癮性［9］。金雀花堿（cytisine）和伐尼克蘭（varenicline）是α4β2 nAChRs的部分激動劑，對α4β2 nAChRs具有很高的親和力，臨床上可用于輔助戒煙，減少戒斷癥狀的發(fā)生［10］，然而這兩種藥物具有許多副作用，限制了它們的用途。伐尼克蘭作為第一個上市的靶向激動α4β2 nAChRs的戒煙藥物，部分激動α4β2 nAChRs后，可抑制尼古丁誘導多巴胺釋放［11］，但是接受伐尼克蘭治療的戒煙者小概率會產(chǎn)生嚴重的精神障礙［12］。但上述激動劑與α4β2 nAChRs 上哪些具體氨基酸相互作用及其調(diào)控機制尚不明確。

已解析的α4β2 nAChRs 結(jié)構(gòu)顯示，α4 亞基中第188 位精氨酸（arginine，Arg，R）與第198 位脯氨酸（proline，Pro，P）分布于α4β2 nAChRs 胞外結(jié)構(gòu)域C-loop 周圍，可能參與激動劑調(diào)節(jié)離子通道開放［13］。與高度同源的α3亞基序列比對發(fā)現(xiàn)，Arg-188和Pro-198 位點發(fā)生了變異，分別突變?yōu)楫惲涟彼幔╥soleu?cine，Ile，I）和谷氨酰胺（glutamine，Gln，Q），且在尼古丁誘導下，α4β2 和α3β2 nAChRs 激發(fā)電流有一定差異［14］。在此基礎(chǔ)上，本研究以點突變的方式，構(gòu)建了3 種鼠源α4β2 nAChRs 突變體α4（R188I）β2、α4（P198Q）β2和α4（R188I，P198Q）β2，利用ACh、尼古丁、金雀花堿與伐尼克蘭4 種激動劑，測試它們調(diào)控α4β2 nAChRs 及其突變體通道開放活性，期待發(fā)現(xiàn)激動劑與受體相互作用的關(guān)鍵位點，為激動劑作用于α4β2 nAChRs的分子機制提供理論支持。

材料和方法

1 動物、菌種和載體質(zhì)粒

成熟雌性非洲爪蟾（Xenopus laevis）購自Nasco，手術(shù)取卵前飼養(yǎng)3周以上，日常飼養(yǎng)環(huán)境為17℃。大腸桿菌（E.coli）DH5α 感受態(tài)細胞購自生工生物工程（上海）股份有限公司；包含大鼠α4 和β2 nAChRs亞基基因的質(zhì)粒由Stephen F.Heinemann 教授（Salk Institute，La Jolla，CA，USA）惠贈；大鼠α4 nAChRs亞基突變體的質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建。

2 主要試劑與儀器

質(zhì)粒提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒片段純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ購自TaKaRa；DNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（mMESSAGE mMACHINE?SP6 Transcription Kit）和RNA 純化試劑盒（MEGAclear?Transcription Clean-Up Kit）購自Thermo Fisher；伐尼克蘭和金雀花堿購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ACh 和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自Sigma-Aldrich；HEPES 和核酸染色劑（4S Red Plus Nucleic Acld Stain）購自BBI 生命科學有限公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純，購自廣州化學試劑廠；ND96 溶液（96.00 mmol/L NaCl，5.00 mmol/L HEPES，2.00 mmol/L KCl，1.80 mmol/L CaCl2·2H2O，1.00 mmol/L MgCl2·6H2O，pH 7.50）；OR2 溶液（82.50 mmol/L NaCl，2.00 mmol/L KCl，1.00 mmol/L MgCl2，5.00 mmol/L HEPES，pH 7.50）。

Axon 900A 雙電極電壓鉗系統(tǒng)購自Molecular Devices Corp；Nanoliter 2000 顯微注射儀購自Sutter；KCL-2000A 恒溫恒濕培養(yǎng)箱購自EYELA；小型水平電泳儀購自Bio-Rad；紫外可見分光光度計購自NanoDrop；Alphalmager MiNi 凝膠成像系統(tǒng)購自Pro?tein Simple。

3 主要方法

3.1 nAChRs 亞基質(zhì)粒的提取、酶切與純化 分別將含有α4、α4（R188I）、α4（P198Q）、α4（R188I，P198Q）和β2 nAChRs亞基基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，于LB 固體培養(yǎng)基上37℃靜置培養(yǎng)16 h。挑取單菌落置于LB 液體培養(yǎng)基中，以250 r/min 的轉(zhuǎn)速于37℃恒溫培養(yǎng)12 h 后，使用質(zhì)粒提取試劑盒大量提取包含α4、α4（R188I）、α4（P198Q）、α4（R188I，P198Q）和β2 nAChRs 亞基基因的質(zhì)粒。分別使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ將含有α4（野生型和突變型）、β2 亞基基因的質(zhì)粒酶切成線性。使用質(zhì)粒片段純化試劑盒對線性質(zhì)粒純化并回收，運用1%瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計檢測線性質(zhì)粒的純度與濃度。

3.2 nAChRs 亞基cRNA 的制備與純化 以包含nAChRs 亞基DNA 分子的線性質(zhì)粒作為模板，SP6 作為啟動子，于37℃水浴中進行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)時間6 h。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，加入2 μL TUBRO DNA 酶，置于37℃水浴20 min，用以酶解DNA 線性模板。使用RNA 純化試劑盒對cRNA 進行純化并回收，用紫外分光光度計檢測其濃度和純度。將純化后的cRNA存于-80℃待用。

3.3 非洲爪蟾卵母細胞的獲取與顯微注射 選取成熟的雌性非洲爪蟾，冰凍麻醉1 h 后，手術(shù)取出適量卵葉，將大團塊剪碎后置于OR2溶液中，用膠原酶將其酶解分離成單個細胞后，用OR2 溶液洗凈酶液［15］。在顯微鏡下篩選動植物級界限分明、健康圓潤飽滿的卵母細胞用于顯微注射。將α4 和β2 亞基cRNA 以質(zhì)量比1∶1 混合均勻后，按每個細胞50.6 nL 進行顯微注射，每個卵母細胞內(nèi)的單亞基cRNA量為20～30 ng。將注射后的卵母細胞置于ND96 溶液（含有青霉素10 mg/L、鏈霉素10 mg/L 和慶大霉素100 mg/L）中，在17℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d 用于電生理活性檢測。

3.4 α4β2 nAChRs 及其突變體的電生理檢測與數(shù)據(jù)分析 在室溫條件下，使用Axon 900A雙電極電壓鉗系統(tǒng)對α4β2 nAChRs 及其突變體進行電生理檢測。將卵母細胞固定于50 μL細胞槽中，使用玻璃微電極的電阻為0.5～2 MΩ，鉗制電壓為-70 mV，ND96溶液（含有0.1 g/L BSA）灌流速度為2 mL/min。在1 min 的灌流時間內(nèi)，給予卵母細胞1 s的激動劑刺激，促使受體通道開放，產(chǎn)生內(nèi)向電流。使用Clampfit 10.6軟件，采集和處理在不同濃度的激動劑誘導下，α4β2 nAChRs 及其突變體通道開放時產(chǎn)生的峰值電流幅度。以10 mmol/L ACh 誘導產(chǎn)生的峰值電流作為基礎(chǔ)值，其他濃度激動劑誘導產(chǎn)生的電流與基礎(chǔ)值的比值為反應(yīng)率［Response（%）］。計算尼古丁的Response 時，則以10 μmol/L 尼古丁誘導產(chǎn)生的峰值電流作為基礎(chǔ)值。部分激動劑誘導產(chǎn)生的最大電流I與ACh（10 mmol/L）產(chǎn)生的最大電流值Imax的比值，為部分激動劑對受體的最大激動效率（maximum effi?cacy，Emax）。每個濃度的激動劑使用6個以上的卵母細胞進行電生理檢測。運用GraphPad Prism 7.0 軟件，根據(jù)非線性擬合方程Response（%）=100/［1+（EC50/［agonist］）nH］（其中nH 代表Hill 系數(shù)），計算激動劑對α4β2 nAChRs 及其突變體的半數(shù)有效濃度（concentration of 50%maximal effect，EC50）［16］。

4 統(tǒng)計學處理

用Graph Pad Prism 7.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果圖中Response 與Emax均采用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 α4β2 nAChRs及其突變體的構(gòu)建與功能表達

α4、α4（R188I）、α4（P198Q）、α4（R188I，P198Q）和β2 nAChRs 亞基基因質(zhì)粒提取與酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（圖1）與紫外分光光度計檢測其純度與濃度。酶切前，質(zhì)粒為環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，與線性質(zhì)粒相比，在瓊脂糖凝膠中移動時阻力較小，遷移速度更快。α4（野生型和突變型）和β2 亞基質(zhì)粒酶切前后濃度均高于0.3 g/L，A260/A280值在1.80 左右，以線性質(zhì)粒為模板，體外轉(zhuǎn)錄得到cRNA，紫外分光光度計檢測其純度與濃度，結(jié)果顯示，各個亞基的cRNA濃度均高于0.2 g/L，A260/A280值在2.0～2.1 之間，濃度與純度均滿足表達的要求（表1）。

運用雙電極電壓鉗系統(tǒng)，檢測α4β2 nAChRs 及其突變體在卵母細胞中的表達情況。以ACh 作為激動劑，在0.01～10 000 μmol/L 的范圍內(nèi)，野生型與突變型α4β2 nAChRs對ACh 的反應(yīng)率均隨著其濃度的增大而提高（圖2A）。與wt α4β2 nAChRs對比，當α4亞基的188位Arg 突變成Ile 后，α4β2 nAChRs 的ACh濃度-反應(yīng)曲線幾乎無變化；α4 亞基198 位由Pro 突變成Gln 后，α4β2 nAChRs 的ACh 濃度-反應(yīng)曲線具有左移趨勢；α4 亞基188 位和198 位雙點突變后，ACh 濃度-反應(yīng)曲線明顯左移。ACh 對wt α4β2 和α4（R188I，P198Q）β2 nAChRs 的EC50分別為67.15 μmol/L 和1.37 μmol/L，wt α4β2 nAChRs 的EC50是α4（R188I，P198Q）β2 nAChRs的50倍，見表2。

2 尼古丁對α4β2 nAChRs及其突變體的激動作用

尼古丁是nAChRs 的完全激動劑，在0.01～10 μmol/L 的范圍內(nèi)，野生型與突變型α4β2 nAChRs 對尼古丁的反應(yīng)率均隨著其濃度的增大而提高（圖2B）。尼古丁對wt α4β2 nAChRs 的EC50為1.431 μmol/L，明顯小于ACh 的EC50。相比于wt α4β2 nAChRs，尼古丁對α4（R188I）β2 nAChRs 和α4（P198Q）β2 nAChRs 的EC50均減小，該變化趨勢與ACh 一致。基于單點突變帶來的EC50變化，進一步檢測α4 亞基188 位和198 位雙點突變對尼古丁活性的影響，發(fā)現(xiàn)與wt α4β2 nAChRs 對比，α4（R188I，P198Q）β2 nAChRs 的尼古丁濃度-反應(yīng)曲線明顯左移，且EC50減小為20%，見圖2B、表2。

Figure 1.The agarose gel electrophoresis of α4（wild-type and mutant）and β2 subunit plasmids（A）and linear DNA（B）.M：DNA marker；1：α4；2：α4（R188I）；3：α4（P198Q）；4：α4（R188I，P198Q）；5：β2.圖1 α4（野生型和突變型）和β2亞基質(zhì)粒及線性化質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 α4（野生型和突變型）和β2亞基質(zhì)粒及其cRNA濃度Table 1.The concentrations of plasmids and cRNAs of α4（wild-type and mutant）and β2 subunits

Figure 2.Concentration-response curves of ACh（A）and nicotine（B）for wild-type and mutant α4β2 nAChRs.Mean±SEM. n=6.圖2 乙酰膽堿和尼古丁對α4β2 nAChRs（野生型和突變型）的濃度-反應(yīng)曲線

3 金雀花堿與伐尼克蘭激動α4β2 nAChRs 及其突變體

繼發(fā)現(xiàn)α4 亞基Arg-188 和Pro-198 雙位點突變可提高α4β2 nAChRs對全激動劑ACh 和尼古丁的敏感性后，本研究進一步測試了部分激動劑金雀花堿與伐尼克蘭對這2個突變位點的影響。

以10 mmol/L ACh 誘導產(chǎn)生的電流Imax作為受體全開放基礎(chǔ)值，分別檢測金雀花堿和伐尼克蘭對α4β2 nAChRs 及其突變體的EC50與Emax。電生理結(jié)果顯示，金雀花堿和伐尼克蘭對wt α4β2 nAChRs 表現(xiàn)出部分激動效果（圖3A、E），EC50分別為6.398 nmol/L 和2.142 nmol/L（表2）。α4 亞基Arg-188 和Pro-198 分別單點突變后，金雀花堿與伐尼克蘭對突變型α4β2 nAChRs 的最大激動濃度分別為100 nmol/L 和50 nmol/L，金雀花堿對突變型α4β2 nAChRs 的激動效果明顯增強（圖3B、C），而伐尼克蘭的激動效果無明顯變化（圖3F、G）。圖3 中由10 mmol/L ACh激動產(chǎn)生的部分峰值電流出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象，發(fā)生該現(xiàn)象主要是因為殘留在灌流通道中的高濃度ACh與ND96灌流洗脫液混合后再次刺激受體，繼而產(chǎn)生一個較小的電流峰，該現(xiàn)象的出現(xiàn)不影響峰值電流的檢測。α4亞基Arg-188和Pro-198都突變后，金雀花堿與伐尼克蘭對突變型α4β2 nAChRs 的最大激動濃度分別為100 nmol/L 和10 nmol/L，金雀花堿與伐尼克蘭對wt α4β2 nAChRs 和α4（R188I，P198Q）β2 nAChRs 的Emax均有顯著差異（P＜0.01），見圖4。而這2 個部分激動劑對α4（R188I，P198Q）β2 nAChRs 表現(xiàn)出近乎全激動劑的激動效果（圖3D、H）。

表2 激動劑對α4β2 nAChRs（野生型和突變型）的EC50和EmaxTable 2.EC50and Emaxvalues of the 4 agonists for wild-type and mutant α4β2 nAChRs

討論

α4 亞基是影響尼古丁敏感性的重要因素，激活含有α4 亞基的nAChRs 可影響中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)釋放多巴胺［17］。金雀花堿與伐尼克蘭作為可用于輔助戒煙的特異性α4β2 nAChRs 部分激動劑，臨床戒煙效果優(yōu)于低劑量尼古丁，但可引起部分嚴重的不良反應(yīng)。探究這兩個藥物與α4 亞基之間相互作用的關(guān)鍵位點，有利于闡明激動劑和α4β2 nAChRs 相互作用的分子機制，進而用以指導配體藥物的設(shè)計與結(jié)構(gòu)研究。

本實驗根據(jù)α4β2 nAChRs 的結(jié)構(gòu)特點和保守性，構(gòu)建了3 種突變體，用于研究激動劑與α4β2 nAChRs 相互作用的關(guān)鍵位點。我們應(yīng)用雙電極電壓鉗系統(tǒng)檢測了α4β2 nAChRs 及其突變體在卵母細胞中的活性表達情況。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α4 亞基188位和198 位雙點突變后，α4β2 nAChRs 對ACh、尼古丁、金雀花堿和伐尼克蘭的敏感性顯著增強，首次發(fā)現(xiàn)這兩個位點突變可能會直接影響激動劑的結(jié)合與門控效率。本研究發(fā)現(xiàn)α4β2 nAChRs 對尼古丁的敏感性比ACh 更強，這與前人的研究結(jié)果相一致［18］。此外，研究結(jié)果顯示金雀花堿與伐尼克蘭完全激動了α4（R188I，P198Q）β2 nAChRs，這與它們部分激動wt α4β2 nAChRs 的性質(zhì)相比具有顯著性差異，此現(xiàn)象的分子機制值得深入研究。

α4亞基188位Arg是極性的堿性氨基酸，與不帶電的疏水性Ile 相比，氨基酸的性質(zhì)發(fā)生了改變，這種改變顯著影響了金雀花堿與伐尼克蘭的結(jié)合與門控效率。此外，Nelson［19］和Lester［20］等研究發(fā)現(xiàn)α4β2 nAChRs 的功能性亞基有兩種計量學組成形式：3α：2β 和2α：3β，其中2α：3β 化學計量對ACh 和尼古丁具有約100 倍的親和力，因此在不同化學計量組成下，Arg-188 和Pro-198 突變的影響還有待進一步研究。前期研究表明，nAChRs 亞基中的氨基酸突變會影響亞基的折疊和空間結(jié)構(gòu)［13］，當Arg-188 和Pro-198 同時突變時，可能對α4 亞基的折疊產(chǎn)生影響，使突變型α4β2 nAChRs空間構(gòu)象發(fā)生改變，進而增強金雀花堿與伐尼克蘭的激動活性，雙位點突變體具體如何影響α4β2 nAChRs 的空間結(jié)構(gòu)還未有明確的解釋，有待后續(xù)研究。

Figure 3.The maximum current of wt and mutant α4β2 nAChRs induced by ACh，cytisine and varenicline.圖3 乙酰膽堿、金雀花堿和伐尼克蘭誘發(fā)α4β2 nAChRs（野生型和突變型）的最大電流

Figure 4.The Emaxof wild-type（wt）and mutant α4β2 nAChRs evoked by cytisine and varenicline.Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs wt α4β2.圖4 金雀花堿和伐尼克蘭對α4β2 nAChRs（野生型和突變型）的Emax

綜上所述，α4 亞基Arg-188 和Pro-198 是激動劑與α4β2 nAChRs 相互作用的重要位點，這兩個位點的氨基酸突變可影響金雀花堿和伐尼克蘭對α4β2 nAChRs 的激動效率，但上述藥物與受體之間的具體作用分子機制及其他可能存在的關(guān)鍵氨基酸位點還需通過結(jié)構(gòu)生物學等方法進行進一步研究。