外源性表達NIC通過Hes1依賴的機制下調小鼠氣道柱狀上皮LA-4細胞表達TLR4*

張 瑤，陳麗展，歐陽海峰△

（1空軍軍醫大學西京醫院呼吸內科，陜西西安 710032；2西安國際醫學中心醫院呼吸內科，陜西西安 710100）

Notch 信號通路進化高度保守，在多種生物的發育過程中通過介導細胞間的相互作用而調控細胞分化方向。Notch 信號途徑由配體（Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3 和Dll4）、Notch1～4 受體及下游信號轉導分子和核內應答過程組成。Notch 受體和配體結合后，在早老素依賴的γ-分泌酶的作用下，釋放受體活性胞內段（Notch intracellular domain，NIC），NIC 轉入核內與轉錄因子RBP-J 結合，形成轉錄激活復合物，進而啟動下游Hes和HERP等基因的轉錄表達，其中，抑制性轉錄因子Hes1 是Notch 通路在核內的主要效應分子。我們的前期工作證實，Notch 信號通路通過調控免疫細胞的發育分化過程及氣道結構細胞的功能在哮喘發病中起到重要作用［1-4］。

多項研究證實，Notch 與TLR4 兩條信號通路之間交互調節［5-8］。Notch 和TLR 可協同上調巨噬細胞中Notch配體Jagged1的表達［9］。Notch和TLR可協同上調Notch 下游分子Hes1、Hey 及TLR 下游的細胞因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-12 的表達［8］。巨噬細胞中過表達NICD1（有活性的Notch1 受體胞內段）可抑制TLR4 信號通路下游分子TNF-α 和IL-6的表達［10］。因此，Notch 和TLR4 兩條信號通路之間的交互作用方式存在多樣性。事實上，染色質水平表觀遺傳機制的差異、胞內轉錄因子網絡水平的差異及炎癥細胞因子的差異均可造成Notch 和TLR 信號通路交互作用的多樣性。因此，Notch 與TLR4 在氣道柱狀上皮細胞中的交互調控作用模式有待進一步的研究。

Poltorak 等［11］于1998 年克隆了小鼠TLR4基因。Rehli 等［12］于2000 年克隆了人TLR4基因的啟動子序列并對其轉錄起始位點和基本的轉錄調控元件進行了初步分析，發現單核細胞特異性轉錄因子PU.1 和ICSBP可在單核細胞中正性調控TLR4基因的轉錄和表達。Roger等［13］于2005年證實小鼠TLR4基因轉錄起始位點上游350 bp 以內存在AP-1、Oct-1 及GATA-1 的結合位點，在巨噬細胞中AP-1 和Oct-1 可上調TLR4基因的轉錄和表達，而GATA-1 可下調TLR4基因的轉錄和表達。Ganley-Leal 等［14］證實，人B 細胞和單核細胞中TLR4基因的表達調控機制存在差異。細胞特異性的轉錄因子網絡及表觀遺傳機制共同決定了TLR4基因表達調控模式的不同。氣道上皮細胞中TLR4基因的表達調控模式如何？目前尚無文獻報道。

本研究旨在觀察外源性表達NIC 能否直接調控小鼠氣道柱狀上皮細胞表達TLR4，并闡明其具體分子機制。

材料和方法

1 細胞系

小鼠氣道柱狀上皮LA-4 細胞和大腸桿菌菌株DH5α由空軍軍醫大學生物化學教研室惠贈。

2 主要試劑

pGL3-Basic 質粒和Dual-Luciferase Reporter As?say System 購自Promega；QuickChange Kit 購自Strata?gene；Lipofectamine 2000 Reagent 購自Invitrogen；SYBR Premix EX Taq 試劑盒購自TaKaRa；Notch1、Hes1、TLR4 和β-actin 抗體均購自Santa Cruz（sc-6014、sc-13844、sc-16240和I-19）；Ⅱ抗購自中山生物公司；染色質免疫沉淀（chromatin immunoprecipita?tion，ChIP）Assay Kit購自Upstate Biotechnology。

3 主要方法

3.1 pGL3-TLR4 報告基因質粒的構建 以健康雄性C57/B6小鼠的基因組為模板，克隆小鼠TLR4的啟動子序列，引物的正義鏈序列為5'-AGTGCTAGCAT?GGTGGAGCCTCTTGAGTTTCTC-3'，反義鏈序列為5'-GGCAAGCTTTGTGCTCATGCATATACACACCTG-3'，產物1 582 bp。插入T 載體，測序證實。再轉入pGL3-Basic 質粒，構建pGL3-TLR4。以pGL3-TLR4質粒為模板，按QuickChange Kit 說明書構建Hes 蛋白結合位點N-box 的點突變報告基因質粒pGL3-TLR4-N-box1（-561 位）、pGL3-TLR4-N-box2（-289位）、pGL3-TLR4-N-box3（+175 位）和pGL3-TLR4-Nbox4（+295位）。

3.2 雙螢光素酶報告基因實驗 將LA-4 細胞以每孔2×104個的密度接種于96 孔板，第2 天進行瞬時轉染，方法按Lipofectamine 2000 Reagent 試劑說明書進行。將0.1 μg 報告基因質粒、5 ng 內參照（phRL）質粒和梯度劑量（0、0.02、0.04、0.06、0.08 和0.1μg）的pEF-BOS-NIC 質粒轉染細胞，pEF-BOS-neo 質粒將每孔的轉染總量調整至相同。轉染48 h后吸棄每孔培養液，PBS 洗滌1 次，按Dual-Luciferase Reporter Assay System 說明書進行雙螢光素酶報告基因實驗。

3.3 RT-qPCR 參照Trizol Reagent 說明書提取總RNA，按照RT-PCR 試劑盒程序以總RNA 為模板，oligo-dT 為引物合成cDNA。按SYBR Premix EX Taq試劑盒說明書建立PCR 反應體系，應用ABI PRISM 7300 Real-Time PCR 儀擴增小鼠TLR4 及內參照βactin。計算目的基因表達水平并以2-ΔΔCt表示。TLR4 的上游引物序列為5'-AGGAGAAAGCG?GATACCA-3'，下游引物序列為5'-TGTGAGGAC?TACCGAGCC-3'；β-actin 上游引物序列為5'-GCCT?CAAGATCATCAGCAAT-3'，下游引物序列為5'-AG?GTCCACCACTGACACGTT-3'。

3.4 Western blot 實驗 收集轉染pEF-BOS-NIC 或pEF-BOS-neo 的LA-4 細胞，提取蛋白，分光光度計蛋白定量，用SDS-PAGE 分離，轉移至NC 膜，蛋白封閉液封閉后孵育Ⅰ抗、Ⅱ抗，增強化學發光法顯色。Notch1、Hes1、TLR4 和β-actin 均購自Snta Cuz（sc-6014、sc-13844、sc-16240、I-19）。Ⅱ抗購自中山生物公司。

3.5 ChIP 超聲切割LA-4 細胞的染色質，按ChIP Asay Kt 說明書進行實驗。以實驗得到的DNA 沉淀為模板，real-time PCR 擴增含有N-box 位點的小鼠TLR4啟動子序列片段，引物的正義鏈序列為5'-AG?TACGTTCTCCTTTTAAT-3'，反義鏈序列為5'-GGC?TAGAATCGATCTGCCC-3'，產物589 bp。β-actin 引物序列同3.3。

4 統計學處理

數據以均數±標準差（mean±SD）表示。用SPSS 20.0統計軟件對結果進行t檢驗和單因素方差分析，評價各處理組間是否存在差異。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1 異位過表達NIC可以下調TLR4的表達

為觀察Notch 信號能否調控TLR4 的表達，我們利用pEF-BOS-NIC 轉染LA-4 細胞而上調Notch 信號后，檢測TLR4 的mRNA 和蛋白表達水平。結果顯示，與空對照質粒pEF-BOS-neo 組相比，pEF-BOSNIC 可以顯著降低TLR4 的mRNA 和蛋白表達水平（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.Ectopic overexpression of NIC down-regulated TLR4 expression.A：TLR4 mRNA expression in LA-4 cells transfected with pEF-BOS-NIC and pEF-BOS-neo was detected by RT-qPCR；B：TLR4 protein expression in LA-4 cells transfected with pEF-BOS-NIC and pEF-BOS-neo was detected by Western blot.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs pEF-BOS-NIC group.圖1 異位過表達NIC可以下調TLR4的表達

2 人和小鼠TLR4基因啟動子生物信息學分析結果

為明確Notch 信號能否直接調控TLR4啟動子活性，我們比對分析了小鼠TLR4啟動子（NC_000070.6）和人TLR4啟動子（NC_000009.12）的基因組序列。如圖2 所示，在小鼠和人TLR4啟動子5'端轉錄起始位點附近的相似位置，存在多個Hes 結合位點N-box（CACNAG）。

3 小鼠TLR4啟動子中Hes結合位點的調控作用

為了觀察這些假定的轉錄因子結合位點能否調控轉錄活性，我們克隆了小鼠TLR4啟動子序列，并構建了報告基因質粒pGL3-TLR4。共轉染LA-4 細胞后顯示，隨著NIC 表達質粒pEF-BOS-NIC 劑量的增加，TLR4啟動子活性逐漸降低（P＜0.05），見圖3A。為進一步觀察TLR4啟動子中這些N-box 位點的功能，我們定點突變了這些位點（圖3B）并觀察了點突變對TLR4啟動子活性的影響。如圖3C 所示，-289位N-box 突變導致TLR4啟動子活性顯著增高，而-561、+175 和+295 位N-box 突變對TLR4啟動子活性沒有顯著影響。利用ChIP 的方法在LA-4 細胞中進一步觀察了Hes1是否結合于小鼠TLR4啟動子序列，即利用包含N-box（-289）位點的TLR4啟動子區域的引物PCR擴增Hes1抗體共沉淀的染色體DNA 片段，結果顯示含有Hes1 結合位點的片段可以被Hes1 抗體共沉淀（圖3D）。

討論

Figure 2.Sequence alignment of human and mouse TLR4 promoters.A：N-boxes in human and mouse TLR4 promoters；B：scheme of the 5′regions of the mouse and human TLR4 promoters，indicating the potential Hes recognition sites.TSS：transcrip?tion start site；TLSS：translation start site.圖2 人和小鼠TLR4啟動子序列比對分析

Figure 3.Effects of the Hes-binding sites on mouse TLR4 promoter.A：result of pGL3-TLR4 reporter assay；B：scheme of the site-di?rected mutant of mouse TLR4 in which the N-boxes were disrupted；C：result of site mutant reporter assay；D：result of chromatin immunoprecipitation（ChIP）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs pGL3-LR4+phRL group；△P＜0.05 vs phRL+pEFBOS-NIC+pGL3-TLR4 group；##P＜0.01 vs control group.圖3 小鼠TLR4啟動子中Hes結合位點的調控作用

在本研究中，顯示異位過表達NIC 可以降低小鼠LA-4 細胞中TLR4 的mRNA 和蛋白表達水平。對人和小鼠TLR4基因5'端啟動子序列進行生物信息學分析表明，在轉錄起始位點上、下游的多個相似位置均存在Notch 下游分子Hes 的結合位點N-box，這提示這些基序可能在TLR4 的表達中有調節作用。我們進一步的雙螢光素酶報告基因實驗證實小鼠LA-4 細胞中過表達NIC 可以下調TLR4啟動子活性。點突變報告基因實驗揭示Hes 蛋白可能通過作用于-289 位的N-box 位點而抑制小鼠TLR4啟動子活性。而ChIP 實驗證實Hes1 結合于TLR4基因啟動子區域。因此，我們認為Notch 信號可以通過Hes1 依賴的機制調節TLR4的表達。

Notch 信號相關分子條件性敲除小鼠模型的研究表明，Notch 信號在Clara 前體細胞及氣道上皮細胞的發育中有重要作用［15-16］。Notch/RBP-J/Hes1 在成年個體中也是細胞分化和功能維持的主要調節因素之一。Notch 信號調控了氣道上皮細胞的黏液化生過程［15］。我們的前期研究也證實，Notch 信號通過Hes1 依賴的機制調控氣道杯狀細胞中MUC5AC 的表達［3］。在本研究中，顯示Notch 信號可以通過Hes1依賴的機制直接調控氣道柱狀上皮細胞中TLR4 的表達。因此，Notch 信號在氣道上皮細胞的功能維持中有重要作用。

氣道上皮細胞表達TLR 和PAR1-PAR4 等多種模式識別受體［9，17-18］。近年來的一系列研究證實，氣道上皮細胞受變應原刺激后可合成、分泌胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）［19］、IL-33［20］和IL-25［21］。上述細胞因子一方面能夠募集、活化樹突狀細胞（dendritic cells，DCs），加重變應原特異性的Th2 免疫應答；另一方面，TSLP、IL-33 和IL-25 可不依賴于DCs 和Th2 細胞因子的存在，直接引起嗜酸性粒細胞性氣道炎癥和氣道高反應性等哮喘表型［19-21］。此外，氣道上皮細胞產生的IL-33 和IL-25 可誘導2 型固有淋巴樣細胞（group 2 innate lymphoid cells，ILC2）的發育分化過程［22］，進而不依賴于CD4+T 細胞通過2 型固有免疫應答的機制直接促成哮喘表型的形成［23］。因此，氣道上皮細胞在哮喘發病中有極為重要的作用［21］，而且這也與相關臨床研究結果一致［24］。

研究報道，草花粉變應原刺激NCI-H292 細胞后，Notch 信號相關的74 個基因中，有38 個基因的表達水平有變化，其中，Notch1 和Hes1 的表達下調最顯著，分別下調了2 倍和3.3 倍［25］。我們的研究表明，Hes1的下調可以上調TLR4的表達。而氣道上皮細胞表達TLR4在哮喘發病中有重要作用。Hammad等［26］證實氣道結構細胞（主要是氣道上皮細胞）表達TLR4 是屋塵螨（house dust mite，HDM）抗原誘導小鼠產生哮喘表型的充分必要條件。Tan等［27］證實，氣道結構細胞表達TLR4 是低劑量卵清蛋白（ovalbu?min，OVA）聯合脂多糖誘導小鼠產生哮喘表型的必要條件。McAlees 等［28］利用氣道上皮細胞條件性剔出TLR4 的小鼠模型證實，造血細胞表達TLR4 可誘導中性粒細胞性哮喘表型，而氣道上皮細胞表達TLR4在HDM 和OVA 誘導的小鼠嗜酸性氣道炎癥中有重要作用。因此，Notch 信號通過Hes1 調控氣道上皮細胞表達TLR4 這一機制可能在哮喘發病中有一定的作用。

Notch 信號通過調控T 細胞的分化在哮喘發病中起到重要作用［29］。但是，只有很少的研究報道了Notch 信號可以通過調控氣道結構細胞的功能參與哮喘發病過程。將來需要進一步的研究來觀察體內條件下氣道上皮中Notch 信號對哮喘表型的調控作用?？傊覀兊难芯勘砻?，Notch 信號通路可以在小鼠LA-4 細胞中通過Hes1 依賴的機制直接調控TLR4啟動子活性；該通路有望成為哮喘防治中的靶點。