大鼠脊髓鞘內置管不同固定方式和不同置留時間的比較

葉先才，劉勝兵，閔繼斌

（1 嘉興學院醫學院 浙江 嘉興 314000）

（2 嘉善縣中醫院 浙江 嘉興 314000）

脊髓鞘內置管有助于將微量或小分子藥物定期導入蛛網膜下腔，從而研究藥物對脊髓的結構和功能影響。例如，胡興國等脊髓鞘內給予米諾環素探討了對脊髓G蛋白偶聯受體激酶2 表達的影響[1]。脊髓置管是研究脊髓相關結構功能較常用、且給藥效果較理想的手段[2]。研究發現，脊髓鞘內給藥的導管型號或導管進入的途徑和方式不同，其對實驗大鼠的生存率和脊髓的結構均有不同程度的影響[3]。其中，寰枕后膜置管因導管在脊髓鞘內穿過較長的距離直到腔腰椎膨大處，易對脊髓結構會造成破壞，嚴重的還會引起大鼠癱瘓[4]。該置管方式對于研究周期較長、給藥頻繁而需長期置留的實驗而言，導管長久置留是否影響脊髓結構尚不清楚。此外，對于如何固定體外部分導管，使其完整長久留存，從而保障整個實驗過程中經導管給藥也是很多脊髓置管實驗中需要考慮的問題。有研究通過去除顱頂骨膜，在矢狀縫兩側鉆孔后釘入螺絲，將導管體外部分固定于兩螺絲釘之間，固定在顱骨[5]。這種顱骨鉆孔的固定方法存在手術時間長，實驗操作難度較大等不足。本研究通過體外導管縫合固定，探求一種簡單實用、適合大鼠單籠飼養的體外導管固定方法。通過大鼠脊髓鞘內置管，比較兩種不同導管體外部分固定方式的固定效果，同時觀察PE-10 管置留與否對脊髓結構的影響，為后續脊髓置管實驗提供參考。

1.材料和方法

1.1 實驗動物

雄性健康SD 大鼠30 只，2019 年11 月購自浙江省醫科院，體重300 ～320 g，分籠飼養，自由飲食。

1.2 材料

PE-10 管，50 μl 微量注射器，止血鉗，鑷子，剪刀，手術刀片，紗布，水合氯醛，苯巴比妥鈉。

1.3 方法

實驗分為三組，每組10 只，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/100 g，麻醉后四肢固定于大鼠固定板，頸部用5mL 注射器針管墊起。常規消毒，頸部剪毛，脫毛器脫毛，70%酒精擦拭。手術刀片劃開兩耳中線下的頭頸部皮膚，分離頸部肌肉后，找到寰枕后模，手術鉗夾住兩側肌肉。用1mL 注射器針頭挑破寰枕后膜至清亮腦脊液流出。取PE-10 導管12 cm 由經針頭挑破的寰枕后膜插入6 ～8 cm，以角針、3-0 手術線縫合切口，用石蠟封固PE-10 管暴露的末端，防止腦脊液流出。術后10萬單位青霉素0.5 mL 肌肉注射。

1.3.1 PE-10 兩種管體外固定方式：第一組大鼠PE-10 管體外部分用手術線固定縫合于頭頸部皮膚；第二組大鼠PE-10 管體外部分直立于頭頸部；實驗第三組大鼠為第一組和第二組各隨機取5 只大鼠組成。

1.3.2 PE-10 管脊髓存留對脊髓的影響：第一組和第二組保留PE-10 管至實驗結束，第三組術后第3 d 從脊髓拔除PE-10 管。

1.3.3 脊髓石蠟切片，HE 染色觀察：術后第四周分別各組取2 只大鼠，戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg，腹腔注射），固定后，剪開背部皮膚，分離肌肉，取出脊髓L4/5 部位后固定于4%多聚甲醛固定液，固定48h 后，石蠟切片，HE 染色。

2.實驗結果

2.1 不同固定方式對術后大鼠的死亡率的影響

為了探討不同固定方式對實驗動物死亡率的影響，我們分析了頭頸部皮膚固定和縫合固定后直立兩種方式對大鼠死亡率的影響。結果如表1 所示，術后第2d 至實驗結束，第一組大鼠死亡數2 只，死亡率為13.3%，未見動物癱瘓；第二組未見動物死亡，但觀察到后肢癱瘓大鼠1 只；癱瘓率為6.7%。此外，還觀察到存活大鼠術后手術切口紅腫有滲出液。術后2 周，刀口基本愈合。兩組無顯著差異（P＞0.05）

表1 實驗大鼠死亡與癱瘓統計[n（%）]

2.2 縫合固定后直立的方式明顯優于縫合固定于頭頸部皮膚

PE-10 管體外部分用手術線縫合固定于頭頸部皮膚的實驗組，2 周后，3 只大鼠的PE 管體外部分被損；2 只大鼠的PE 管體外的長度存留不足1cm，不利于后續給藥。PE 管直立于外的實驗組，PE 管存留完好，結果見表2。數據分析表明，縫合固定后直立的方式明顯優于縫合固定于頭頸部皮膚的固定方式（P＜0.05）。

表2 PE-10 管體外兩種不同固定方式的比較

2.3 不同置管方式和置管時間對脊髓結構無影響

為了進一步探討不同置管方式和置留時間是否對脊髓的解剖結構產生明顯影響，我們對不同分組的動物術后第四周進行了病理解剖觀察。結果如圖1 所示，各組大鼠脊髓無明顯結構破壞，脊髓組織結構正常。

圖1 脊髓置管對脊髓結構的影響

3.討論

自Yaksh 等通過大鼠鞘內置管給藥后[6]，脊髓鞘內置管在神經相關的研究中得以廣泛應用，其中，寰枕后膜置管具有手術操作簡單、插管入口明顯、置管便捷等優點。但有文獻報道，該置管方式的早期實驗動物存在一定的死亡率，約3%～5%[4]。此外，因實驗動物的個體有差別，易造成插入位置偏深，導致術后動物出現后肢癱瘓；甚至引起脊髓的結構損傷。但本研究的結果表明，經寰枕后膜置管未見明顯的脊髓結構損傷，這可能與我們在手術過程中對相關操作存在的脊髓損傷等潛在風險顯著重視有關。存留于體外部分的置管常因實驗動物的抓撓而脫落或被咬斷。研究發現，經第5 ～6 椎間脊髓鞘內置管，超過半數以上的體內置管和部分體外存留導管在實驗后的4d 中被破壞[7]。因此，選擇有效的體外固定方法，對脊髓置管的保存有重要意義。本實驗發現，術后大鼠單籠飼養后，固定于頭頸部皮膚的PE-10 管，由于大鼠抓脫而影響后續通過PE-10 管給藥，而PE-10管直立于外，則PE-10 管保持完好，PE-10 管的直立優于固定于頭頸部皮膚。

綜上所述，PE-10 管體外部分直立優于固定于頭頸部皮膚，脊髓鞘內PE-10 管置留時間的長短對脊髓結構無顯著影響。