急性胃黏膜損傷家兔耳胃穴組織學與超微結構變化的研究

游麗梅 ，劉海玲 ，劉繼洪 ，龍翔宇 ，徐光鎮 ，蒲永棚

（1.廣州中醫藥大學，廣州 510405；2.廣州中醫藥大學附屬佛山中醫院，佛山 528000；3.佛山健翔醫院，佛山 528000）

急性胃黏膜損傷（acute gastric mucosal injury，AGMI）是機體在嚴重創傷、燒傷、休克、感染以及內臟功能嚴重受損等多種危重情況下發生的以胃黏膜糜爛、潰瘍、出血為主要特征的急性應激性病變[1]。作為臨床危重疾病的常見并發癥，掌握AGMI的預防與治療手段至關重要。西醫學主要通過抑酸、防酸返流、抗氧自由基、抗細胞黏附因子、促進胃黏膜細胞修復等藥物來進行治療，但僅起到保護胃黏膜層的作用且不良反應明顯，無法完全控制 AGMI的疾病進程[2]。中醫學的臨床方法廣泛，涉及中藥、艾灸、針刺等方面[3-5]。有研究發現，在 AGMI的進程中，炎癥反應是其潰瘍難以愈合及易復發的主要原因[6]，而通過刺激耳穴對胃有興奮和抑制的雙向效應，能夠改善內臟血供從而促進胃黏膜上皮細胞的再生[7-8]。本研究通過觀察耳胃穴組織學和超微結構改變，探究AGMI的炎癥反應與耳胃穴組織結構變化之間的內在聯系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級健康成年新西蘭家兔 20只，普通級，體質量（2.0±2.5）kg，實驗動物使用許可證號為 SYXK（粵）2018-0002，由廣東省醫學實驗動物中心提供并且繁育飼養。單籠飼養，按需喂顆粒飼料（由廣東省醫學實驗動物中心提供），自由飲水，采用每12 h晝夜交替照明，室溫（21±2）℃。動物檢疫結束后，按照體質量進行編號，采用隨機數字表法隨機分為模型組和正常組，每組10只。本實驗涉及的與動物實驗相關的內容和程序遵從國家科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[9]及該機構實驗動物倫理委員會的相關規定。

1.2 主要試劑及儀器

0.1 M磷酸緩沖液（國藥集團，貨號P-3813）；鹽酸賽拉嗪（吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司，批號20180801）；戊巴比妥鈉（德國默克，批號 170108）；環保透明劑（武漢宏茲生物技術有限公司，批號20190325）；環保封片膠（武漢宏茲生物技術有限公司，批號 20190610）；鋨酸晶體（美國 TEDPELLA公司，貨號18456）；乙醇溶液（廣東光華股份有限公司，批號20190621）；100%丙酮溶液（國藥集團 ，貨 號191105-1）；2%醋酸雙氧鈾染色液（美國EMS公司，貨號22400）；檸檬酸鉛（美國 TEDPELLA 公司，貨號 19314）；Epon812樹脂（美國 TED PELLA公司，貨號 GP18010）；石蠟（廣東大川特種蠟有限公司，批號 20171202）；曙紅（天津市天新精細化工開發中心，批號 20180306）；蘇木素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號F162039）。山之峰（Shan Zhi-feng， SZF）健康檢查筆（河南山之峰信息科技股份有限公司，SZF201812211）；生物組織包埋機 （LEICAEG1150）；輪 轉 切 片（LEICARM2235）；超薄切片機（徠卡 UC-7）；光學顯微鏡（奧林巴斯 BX41）；透射電子顯微鏡（日本電子株式會社生產JEM-1400 PLUS）。

1.3 模型制備與鑒定

兩組家兔禁食48 h后，模型組采用無水乙醇溶液灌胃進行造模（劑量為每公斤體質量2.35 mL無水乙醇溶液）[10]，正常組采用與模型組相同體積的純凈水進行灌胃。取模型組所有家兔的胃黏膜組織，經蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下進行胃黏膜組織病理學檢查，確定模型成功。

1.4 耳胃穴定位

耳胃穴的定位是在文獻[11-14]與前期預實驗運用電測法及病理檢查的基礎上確定。耳胃穴位于耳輪腳末端，耳甲艇和耳甲腔交界的上方。預實驗采用本實驗相同的造模方法，于造模成功后48 h，用SZF健康檢查筆對家兔耳胃穴及周邊進行電測，觀察并記錄低電阻點。局部組織經 HE染色，在光鏡下觀察各點組織結構，進一步確定耳胃穴準確定位。電測結果顯示顯著低電阻點位于家兔耳廓耳輪腳A、B、C點，見圖1。選取周圍皮膚同等低電阻點為非耳胃穴，（圖1中位于B點上方1 cm，橫嵴下方，耳中動脈旁近耳甲艇處）。根據光鏡結果，選取最強陽性反應點B點為耳胃穴（本研究提及的耳胃穴均為B點）。

圖1 新西蘭家兔耳廓耳輪腳分區示意圖

1.5 采樣處理

灌胃48 h后，麻醉兩組家兔（每公斤體質量肌肉注射3%戊巴比妥鈉溶液1 mL），再用空氣栓塞法處死。用鋒利刀片切取肉眼病變最明顯處的胃黏膜組織 1～2塊（共約2 cm×3 cm）、左側耳胃穴和非耳胃穴組織（約1 cm×1 cm），和右側耳胃穴組織（米粒狀，約為1 mm×1 mm×1 mm）。

1.6 指標檢測

1.6.1 胃黏膜炎癥評分[15]

對家兔胃黏膜 HE染色切片進行光學顯微鏡觀察并進行胃黏膜炎癥評分。無胃炎為0分；輕度為1分（局部充血、輕度炎癥）；中度為2分（嚴重充血、局部炎癥明顯）；重度為3分（全胃彌漫性炎癥變化）。

1.6.2 耳胃穴組織炎癥分級[16]

對家兔耳胃穴組織 HE染色切片進行光學顯微鏡觀察并進行炎癥分級評價。無明顯炎癥為少量散在炎細胞；輕度為少數炎細胞浸潤；中度為較多炎細胞浸潤，表皮輕度增厚；重度為多數炎細胞浸潤，表皮增厚明顯。

1.6.3 組織的病理學觀察

取兩組左側耳胃穴組織、非耳胃穴組織和胃黏膜組織標本，置于 10%中性甲醛溶液中固定，再進行修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等操作，石蠟切片、HE染色和封片后，置于光學顯微鏡下觀察并記錄組織病理學變化。

1.6.4 超微結構觀察

取兩組右側耳胃穴組織用生理鹽水漂洗，濾紙吸干，置于滴有 2.5%中性戊二醛電鏡固定液的平皿中，放在充滿 2℃～8℃的 2.5%中性戊二醛溶液電鏡固定液的凍存管中，再放置于4℃冰箱內保存。完成組織標本清洗、用1%鋨酸固定、梯度脫水、樹脂滲透包埋、固化、半薄切片定位、50～70 nm厚超薄切片、鈾鉛雙染色等步驟，置于透射電子顯微鏡（transmission electron microscope， TEM）下觀察耳胃穴組織的超微結構并拍攝耳胃穴組織的整體（×5 000）照片以及局部（×30 000）照片。

1.7 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示。胃黏膜炎癥評分比較采用獨立樣本 t檢驗，耳胃穴組織炎癥程度及非耳胃穴組織炎癥程度比較采用卡方檢驗。以 P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組胃黏膜組織病理形態和炎癥評分比較

模型組可見局部胃黏膜糜爛、出血，黏膜層單核細胞、淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，黏膜下層水腫、單核細胞及中性粒細胞浸潤；正常組未見明顯異常變化，部分正常組家兔出現胃黏膜的輕度炎癥反應可能因灌胃操作造成的實驗性應激性胃黏膜損傷[10]。詳見圖 2。表明本實驗造模方法合理且可成功復制。

圖2 兩組胃黏膜病理形態比較（HE染色，×200）

與正常組比較，模型組胃黏膜炎癥評分明顯升高，組間差異具有統計學意義（P＜0.01）。詳見表1

表1 家兔胃黏膜組織病理觀察

2.2 兩組耳胃穴組織病理形態和炎癥分級比較

模型組耳胃穴組織可見表皮角質層疏松，局部變薄，表皮（棘層、基底層）及真皮增厚，局部真皮致密結締組織排列疏松及炎癥細胞浸潤；正常組未見明顯變化，詳見圖3。模型組胃黏膜組織與耳胃穴組織病理形態比較，發現隨著胃黏膜組織炎癥程度的加重，耳胃穴組織的炎癥程度也相應加重。模型組中，胃黏膜炎癥程度分級與耳胃穴組織炎癥程度分級比較，存在個體差異。模型組耳胃穴組織的炎癥程度明顯高于正常組，組間比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。詳見表2。

圖3 兩組胃黏膜和耳胃穴組織病理形態比較（HE染色，×200）

表2 兩組耳胃穴組織炎癥分級比較

2.3 兩組非耳胃穴組織病理形態和炎癥分級比較

兩組各有 9例的非耳胃穴組織未見異常變化，兩組各有1例出現非耳胃穴組織局部表皮增厚、真皮層單核細胞及中性粒細胞浸潤，詳見圖4。模型組非耳胃穴組織炎癥分級與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

圖4 兩組非耳胃穴組織病理形態比較（HE染色，×200）

表3 兩組非耳胃穴組織炎癥分級比較

2.4 兩組耳胃穴組織超微結構比較

正常組家兔耳胃穴組織結構未見異常，可見角質細胞排列緊密，大量結構正常的橋粒。模型組家兔胃黏膜發生輕度炎癥時，耳胃穴組織可見胞漿角蛋白絲聚集，細胞間隙增寬，大量結構正常的橋粒，胞漿線粒體輕度腫脹。模型組家兔胃黏膜發生中度炎癥時，耳胃穴組織可見細胞間隙增寬，少量結構正常的橋粒，胞漿角蛋白絲聚集，線粒體腫脹、空泡變性。模型組家兔胃黏膜發生重度炎癥時，耳胃穴組織可見細胞間隙增寬，胞漿角蛋白絲聚集，少量結構不清的橋粒，胞漿線粒體腫脹、空泡變性以及線粒體自噬。隨著胃黏膜炎癥程度的加重，耳胃穴超微結構的變化更明顯。詳見圖5。

圖5 兩組耳胃穴組織超微結構比較

3 討論

《靈樞·口問》：“耳者，宗脈之所聚也。”依據中醫學經絡學說，六陽經都直接或間接地上耳前或耳中，六陰經則通過與陽經的絡屬關系間接地與耳發生聯系，臟腑的生理或病理活動均可通過經絡反映于耳。中醫學認為人體是有機統一的整體，當某個部位發生病變時，在耳廓的相應穴區上會出現陽性反應點。劉繼洪等[17]運用B超或胃鏡等現代醫學診斷手段證實“定位穴”（即陽性反應點）與腹腔臟器相對應的關系。西醫學認為耳廓是一個具有獨特的局部反應整體全息的微觀世界。Montazeri M等[18]通過對伊朗德黑蘭心臟中心的冠心病患者對耳垂皺褶進行評估，得出斜角耳垂皺褶可作為診斷冠心病的指標。中、西醫學在耳廓反應點的認識上不謀而合，通過陽性反應點來推斷疾病的部位進行治療，在臨床上具有一定的指導意義[19]。既往實踐研究表明，針刺耳胃穴可改善胃血液循環障礙，促進胃黏膜上皮細胞的再生[20]，這提示耳胃穴與胃黏膜之間存在某種關聯機制。據此，本實驗以AGMI的炎癥反應為切入點，探究急性胃黏膜損傷家兔胃黏膜的炎癥反應與耳胃穴組織學和超微結構變化的內在聯系。

正常兔耳菲薄、柔軟，其上可見清晰的毛細血管，而臟腑發生病變時，耳廓的相應部位上出現變色、變形、血管充盈、脫屑或丘疹等變化，即為陽性反應。通過觀察這些陽性反應點的組織，可發現與臟腑病變相關的耳穴發生皮膚角化層變薄，甚至消失，棘層增生變厚，局部出現大量的炎性細胞浸潤等組織學變化[21-22]。本研究中，模型組耳胃穴組織學表現為角質層疏松，局部變薄，局部表皮（棘層和基底層）及真皮增厚，真皮致密結締組織排列疏松，單核細胞及中性粒細胞浸潤等病理改變，而正常組沒有明顯改變。同時，模型組與正常組的非耳胃穴未出現異常改變，這說明模型組耳胃穴組織出現炎癥反應，病理結構改變符合陽性反應點的組織變化，且該變化不存在于其他部位。

此外，耳胃穴組織電鏡下有不同程度的超微結構變化，主要表現在橋粒與線粒體的改變。橋粒為上皮細胞特有的一種細胞間黏著結構，通過張力絲發揮細胞與細胞間的連接作用來維持細胞間黏附力，從而保持細胞形態，抵抗機械刺激，維持組織的完整性。當皮膚出現炎癥反應時，可出現橋粒數量的減少和結構的破壞[23-24]。正常組電鏡下可見大量結構正常的橋粒，而模型組橋粒明顯減少，甚至部分結構不清。同時，炎癥的發生、發展與線粒體功能密切相關，線粒體不僅可以調控固有免疫細胞中的炎癥反應，也可以作用于炎癥介質從而介導炎癥的產生。大量的炎癥因子不僅可以改變細胞的生理狀態，而且可以影響線粒體的融合與分裂，使線粒體的功能和結構都發生巨大的變化[25]。線粒體常見的病理改變是線粒體腫脹，線粒體極度腫脹時可轉化成小空泡狀結構，當線粒體進一步受損，就會激活線粒體自噬這一自我保護機制，選擇性清除受損傷或多余線粒體以維持細胞穩態[26]。模型組耳胃穴組織電鏡下可見胞漿線粒體腫脹、空泡變性及線粒體自噬。橋粒和線粒體的這些改變可表明耳胃穴組織出現炎癥反應。

正常胃黏膜細胞對損傷有一定的抵抗能力，而損傷的形成與各種細胞因子和炎癥介質有關，在各種細胞損傷因子的作用下，胃黏膜發生炎癥并產生大量的炎癥因子，造成中性粒細胞浸潤[27]。隨著胃黏膜炎癥程度的加重，急性胃黏膜損傷家兔耳胃穴組織學和超微結構變化更明顯，耳胃穴作為胃黏膜損傷的陽性反應點，主要表現為組織的炎癥反應。以上說明耳胃穴的炎癥反應機制可能與 AGMI胃黏膜損傷機制存在某種關聯。

本文通過對急性胃黏膜損傷家兔耳胃穴的組織學及超微結構的觀察，明確了耳胃穴診治胃部病變的價值。耳穴指導臨床診治疾病療效顯著，但由于耳穴與機體之間存在著極其復雜的多層次、多途徑的聯系[28-29]，其內在機理至今尚未明確。基于中西方不同的起源及理論背景，耳穴基礎研究的豐富與完善彌足重要。借助現代醫學理論在細胞及超微結構的微觀層面來解釋耳穴作用原理，能夠達到中西醫的交融貫通，從而提高醫者的診療水平，促進外界對“耳穴醫療”的認可與接受[30]。