血清miR-135b、ANGPTL3與冠心病患者Gensini積分的相關性分析

劉麗梅, 李志明, 劉新, 陳萍, 徐龍

1銀川市中醫醫院(寧夏醫科大學附屬中醫醫院)心病科(寧夏銀川 750001)； 寧夏醫科大學 2生育力保持重點實驗室， 3病理生理實驗室(寧夏銀川 750004)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病即冠心病，是臨床常見心血管疾病，被全球公認為是致病與死亡的主要原因，并隨全球老齡化加劇，其發病率和死亡率呈持續上升趨勢[1]。冠狀動脈粥樣硬化是冠心病主要病理變化，嚴重影響患者病情及預后，因此，對冠心病患者疾病嚴重程度進行判定及進行針對性治療，對降低患者致殘率與死亡率極為重要[2]。近年來，有大量研究證實微小RNA(microRNA，miRNA)參與多種疾病發生、發展，有研究發現，miR-135b-5p參與動脈粥樣硬化中內皮細胞與血管平滑肌細胞增殖和遷移[3]。血脂代謝紊亂是導致冠心病的重要因素，在動脈粥樣硬化中扮演重要角色，有研究發現，血管生成素樣蛋白3(angiopoientin-like protein 3，ANGPTL3)與調節脂質代謝功能密切相關[4]。而Gensini積分是反映冠狀動脈狹窄程度的重要指標。因此，本研究旨在探討血清miR-135b、ANGPTL3與冠心病患者Gensini積分的相關性，為其臨床治療及機制研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月至2019年3月本院收治的110例冠心病患者進行研究(研究組)，選取同期100例體檢健康者作為對照組。

納入標準：(1)符合冠心病診斷標準[5]；(2)經冠狀動脈造影證實；(3)患者知情，簽署知情同意書；(4)經本院倫理委員會審查批準。

排除標準：(1)伴先天性心臟病者、心肌病等心血管疾病者；(2)合并甲狀腺疾病者；(3)伴活動性肝、腎疾病者；(4)合并嚴重感染者；(5)近期有影響血脂藥物服用史者；(6)伴嚴重凝血功能障礙者；(7)合并惡性腫瘤者。

研究組男58例，女52例；年齡51～82歲，平均(64.28±6.72)歲；體質指數21.08～24.83 kg/m2，平均(23.14±0.84)kg/m2；美國紐約心臟協會心功能分級：Ⅰ級45例，Ⅱ級35例，Ⅲ級30例；對照組男54例，女46例；年齡53～85歲，平均(65.51±6.32)歲；體質指數21.15～24.95 kg/m2，平均(23.19±0.87)kg/m2，兩組受試者性別、年齡、體質指數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器 Trizol(美國，Invitrogen)、逆轉錄試劑盒(日本、TAKARA)、熒光定量PCR試劑盒(日本、TAKARA)、ANGPTL3試劑盒(美國，UCL)、普通PCR儀(德國，Biometra)、Roche 480型Real-time PCR儀(瑞士，Roche)、ELx800全自動酶標儀(美國，BioTek)、7020全自動生化儀(日本，日立)。

1.3 方法 (1)血清miR-135b水平檢測，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測受試者血清miR-135b水平，miR-135b上游引物序列：5′-CCTGGCTTTTCATTCCTATGTGA-3′，下游引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCCACATATACTAAA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′，Trizol提取總RNA，進行逆轉錄，以逆轉錄cDNA為模板設計qRT-PCR反應體系進行擴增，反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環，采用2-ΔΔCT方法計算血清miR-135b相對表達量；(2)血清ANGPTL3水平檢測，采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清ANGPTL3水平，實驗步驟參照試劑盒說明書操作；(3)血脂指標檢測，采用全自動生化儀檢測受試者血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)水平；(4)Gensini積分，應用冠狀動脈造影測量左主干、前降支、回旋支及右冠狀動脈管腔內徑，無狹窄記0分，<25%記為1分，25%～50%記為2分，51%～75%記為4分，76%～90%記為8分，91%～99%記為16分，完全狹窄記為32分，最終積分為各冠脈分支積分之和，得分越高，冠狀動脈狹窄程度越嚴重。

2 結果

2.1 兩組受試者血清miR-135b、ANGPTL3水平比較 研究組患者血清miR-135b、ANGPTL3水平均明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組受試者血清miR-135b、ANGPTL3水平比較

2.2 兩組受試者血脂指標比較 研究組患者血清TC、TG、LDL-C水平均顯著高于對照組(P<0.05)，HDL-C水平低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受試者TC、TG、LDL-C及HDL-C水平比較

2.3 不同冠狀動脈狹窄程度血清miR-135b、ANGPTL3水平比較 根據冠狀動脈造影結果將患者分為低危組(Gensini積分≤20分)、中危組(21分≤Gensini積分<60分)、重危組(Gensini積分≥60分)，重危組、中危組患者血清miR-135b、ANGPTL3水平高于低危組(P<0.05)，重危組高于中危組(P<0.05)，見表3。

表3 不同冠狀動脈狹窄程度血清miR-135b、ANGPTL3水平比較

2.4 冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3水平與血脂指標相關性 冠心病患者血清miR-135b與TC、TG、LDL-C呈正相關(P<0.05)，與HDL-C呈負相關(P<0.05)；血清ANGPTL3水平與TG、LDL-C呈正相關(P<0.05)，與HDL-C呈負相關(P<0.05)，與TC無相關性(P>0.05)，見表4。

表4 冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3水平與血脂指標相關性

2.5 冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3及Gensini積分之間關系 冠心病患者血清miR-135b表達與ANGPTL3、Gensini積分[(53.81±15.48)分]呈正相關(r=0.473，P=0.000；r=0.301，P=0.001)，見圖1、2；ANGPTL3表達與Gensini積分呈正相關(r=0.483，P=0.000)，見圖3。

圖1 冠心病患者血清miR-135b與ANGPTL3表達相關性

圖2 冠心病患者血清miR-135b與Gensini積分表達相關性

圖3 冠心病患者血清ANGPTL3與Gensini積分表達相關性

3 討論

冠心病是嚴重威脅全球人類健康的重要疾病之一，其防治在全球范圍內仍是一個巨大的挑戰，有調查報道，至2030年，冠狀動脈疾病將成為全球四大死亡原因之一[6]。冠心病的致病因素多而復雜，與飲食、飲酒、高血壓、糖尿病、凝血功能異常及遺傳等因素相關[7]。冠狀動脈狹窄程度對患者預后十分重要，冠狀動脈造影是冠心病診斷金標準，能較精確的評估患者動脈狹窄程度，但其費用較高，具有輻射危害，且造影劑的使用也可引起一定不良反應。因此，尋找與冠狀動脈狹窄密切相關的檢測指標，對提高冠心病患者預后有重要臨床意義。

miRNA是近年來研究的熱點，在個體發育、細胞增殖、凋亡及疾病發生、發展中發揮重要作用。有研究發現，miRNA在脂質代謝及動脈粥樣硬化的發展過程中起著重要作用。Ren等[8]研究發現，mir-330能通過調控WNT信號通路靶向作用于絲裂原激活蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)調節血管內皮細胞增殖，其過表達可抑制動脈粥樣硬化斑塊形成。王玲等[9]研究，mir-24在冠心病血漿中低表達，并與Gensini積分呈負相關，其高表達對冠狀動脈起到一定保護作用。miR-135b為新發現的miRNA，在糖尿病、結腸腺癌、骨肉瘤等疾病中異常表達[10]。本研究結果顯示，與對照組比較，研究組患者血清miR-135b水平明顯升高，提示miR-135b在冠心病患者血清中過表達。ANGPTL3是一種分泌型蛋白質，在人體內主要表達于肝臟，其蛋白分子中的氨基端的螺旋樣結構域可調節脂質代謝，而羧基端的纖維蛋白原樣結構域參與血管生成[11]。Olkkonen等[12]研究發現，在心血管疾病中以ANGPTL3為治療靶點，對動脈粥樣硬化性心血管疾病有良好治療效果。本研究結果顯示，研究組患者血清ANGPTL3水平明顯高于對照組，與Stitziel等[13]研究結果相似，提示冠心病患者血清ANGPTL3水平升高。冠心病患者通常表現為血脂異常，TC、TG、LDL-C、HDL-C是重要的血脂指標，TC、TG易受飲食影響，對冠心病預測價值較小，而LDL-C可促進動脈粥樣硬化發生，其水平降低可降低冠心病發病率，HDL-C是抗動脈粥樣硬化的脂蛋白，為冠心病保護因子[14-15]。本研究結果顯示，與對照組比較，研究組患者TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，提示冠心病患者存在血脂異常現象。進一步研究發現，重危組、中危組患者血清miR-135b、ANGPTL3水平高于低危組，重危組高于中危組，提示血清miR-135b、ANGPTL3水平隨著冠心病患者冠狀動脈狹窄程度升高而升高。Su等[16]研究報道，在心血管疾病小鼠模型中，ANGPTL3失活可明顯降低TG、LDL-C水平，減輕動脈粥樣硬化病變大小，改善血脂異常，降低心血管疾病發生風險。本研究結果顯示，冠心病患者血清miR-135b與TC、TG、LDL-C呈正相關，與HDL-C呈負相關，血清ANGPTL3水平與TC、LDL-C呈正相關，與HDL-C呈負相關，與Xu等[17]研究結果相似，提示miR-135b、ANGPTL3可能通過調控血脂水平參與冠心病發生、發展。最后研究發現，血清miR-135b表達與ANGPTL3、Gensini積分呈正相關，ANGPTL3表達與Gensini積分呈正相關，提示miR-135b、ANGPTL3與冠狀動脈狹窄程度相關，兩者可能通過協同作用參與冠心病進展過程。TC、TG、LDL-C水平升高可促進冠心病患者動脈斑塊形成，加重患者冠狀動脈狹窄程度，miR-135b、ANGPTL3可能通過協同作用調控表達TC、TG、LDL-C、HDL-C表達參與冠心病發生、發展。

綜上所述，本研究發現，冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3均高表達，兩者表達呈正相關，并與血脂指標、Gensini積分相關，可能成為冠狀動脈狹窄程度判定的輔助檢測指標。但本研究尚存不足之處，如樣本量納入較少，為單中心研究，有待擴大樣本量、開展多中心研究進一步探討miR-135b、ANGPTL3在冠心病中作用機制，為其臨床治療帶來新突破。